薄殼山核桃‘馬漢’雄蕊發(fā)育特性及花粉儲(chǔ)藏活力

楊先裕，黃堅(jiān)欽，徐奎源，夏國(guó)華，袁紫倩，3，凌驊，王正加

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安 311300；2.浙江省建德市林業(yè)局，浙江建德311600；3.浙江省杭州市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江杭州 310016）

薄殼山核桃‘馬漢’雄蕊發(fā)育特性及花粉儲(chǔ)藏活力

楊先裕1，黃堅(jiān)欽1，徐奎源2，夏國(guó)華1，袁紫倩1，3，凌驊1，王正加1

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安 311300；2.浙江省建德市林業(yè)局，浙江建德311600；3.浙江省杭州市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江杭州 310016）

為解決薄殼山核桃Carya illinoensis花期花粉的采集和有效保存等問(wèn)題，系統(tǒng)觀測(cè)雄蕊開花習(xí)性，采用熒光染色反應(yīng)（FCR）法研究了不同散粉期花粉生活力差異，以及不同儲(chǔ)藏條件（室溫密封、室溫密封干燥；4℃密封、4℃密封干燥；-70℃密封、-70℃密封干燥）和儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)花粉活力的影響。結(jié)果表明：①4月26日薄殼山核桃雄蕊花萼開裂，5月6日花藥由綠變黃，5月7-9日雄蕊進(jìn)入散粉期，5月8日散粉量最大，占花粉總量的75%，至5月10日花粉基本散盡，花藥變黑、小花開始脫落；②散粉期花粉生活力大小依次為即將散粉期（花藥由綠變黃）＞散粉初期＞散粉盛期＞散粉末期，花粉耐儲(chǔ)藏性亦是即將散粉期最優(yōu)，即將散粉期＞散粉初期＞散粉盛期＞散粉末期。③儲(chǔ)藏條件對(duì)花粉活力的保持有顯著影響，利于花粉生活力保持的儲(chǔ)藏條件依次為-70℃密封干燥＞-70℃密封＞4℃密封干燥＞4℃密封＞室溫密封干燥＞室溫密封；在任一儲(chǔ)藏條件下，花粉活力均隨儲(chǔ)藏時(shí)間而下降，干燥與不干燥差異不顯著。室溫下花粉活力下降最快，50 d后花粉已經(jīng)完全喪失活力；4℃下花粉活力次之，120 d后花粉已經(jīng)完全喪失活力；-70℃超低溫條件下保存效果最好，與常溫、低溫儲(chǔ)藏差異極顯著，儲(chǔ)藏360 d花粉還保持43.55%的活力。圖4表3參19

經(jīng)濟(jì)林學(xué)；薄殼山核桃‘馬漢’；發(fā)育特性；花粉生活力；儲(chǔ)藏條件；熒光染料反應(yīng)

薄殼山核桃Carya illinoensis是一種重要的木本油料樹種，又是珍貴的干果樹種［1］。中國(guó)的亞熱帶東部地區(qū)、長(zhǎng)江流域和云南等10多個(gè)省均建立了薄殼山核桃引種區(qū)，并已建成種質(zhì)資源庫(kù)、采穗圃、品種園和早實(shí)豐產(chǎn)示范林［2］。到目前為止，薄殼山核桃生產(chǎn)在國(guó)內(nèi)仍未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，堅(jiān)果消費(fèi)大部分依賴進(jìn)口，造成這種現(xiàn)象的一個(gè)重要原因是建園時(shí)未科學(xué)配置授粉樹，導(dǎo)致授粉不良，生理落果嚴(yán)重［3］。薄殼山核桃是典型的雌雄同株、雌雄異熟植物，在建園時(shí)需要注意品種搭配，選擇雌雄花期相匹配并且能夠相互親和的品種搭配種植，必要時(shí)在花期進(jìn)行人工輔助授粉［4］。在生產(chǎn)中，薄殼山核桃散粉期，僅2～3 d，而雌花發(fā)育進(jìn)程不一，且有等待授粉習(xí)性，短期內(nèi)不能充分授粉，人工輔助授粉是一項(xiàng)重要的豐產(chǎn)措施［5］。所以花粉的采集和有效保存在生產(chǎn)中具有重要意義。薄殼山核桃‘馬漢’‘Mahan’品種是當(dāng)前中國(guó)栽培最為廣泛的品種之一，也是常用的授粉品種。本研究以品種‘馬漢’為研究對(duì)象，通過(guò)研究不同散粉期花粉活力差異以及不同儲(chǔ)藏條件和儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)花粉活力影響的研究，找出最佳的花粉采集時(shí)間和最適儲(chǔ)藏條件，為人工輔助授粉提供最優(yōu)保證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于浙江省建德市蓮花鎮(zhèn)齊平村薄殼山核桃早實(shí)豐產(chǎn)試驗(yàn)林基地，29°34′42″N，119°18′21″E，海拔為110 m，年平均氣溫為16.0℃，年降水量1 818.8mm。供試材料為薄殼山核桃‘馬漢’品種12年生健康植株。散粉期花粉活力測(cè)定材料取即將散粉期（花藥由綠變黃）、散粉初期、散粉盛期、散粉末期雄花序散出花粉，不同儲(chǔ)藏條件花粉活力測(cè)定的花粉取自散粉盛期雄花序散出的花粉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 物候期觀察方法調(diào)查方法參考《經(jīng)濟(jì)林研究法》《果樹研究法》中有關(guān)生物學(xué)調(diào)查部分和山核桃的一些性狀調(diào)查方法［6］。在基地挑選3株?duì)I養(yǎng)水平相近、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的植株作為標(biāo)準(zhǔn)株，取每植株?yáng)|、南、西、北4個(gè)方向，每個(gè)方向選取10個(gè)結(jié)果枝進(jìn)行掛牌，觀察記錄雄花芽萌動(dòng)日期、雄花序生長(zhǎng)日期、花萼開裂期、花藥由綠變黃、散粉初期（以25%小花花藥散開為標(biāo)準(zhǔn)）、散粉盛期（以50%以上小花花藥散開為標(biāo)準(zhǔn)）、散粉末期（以花藥完全開裂，花粉基本散盡，花序變黑褐色為標(biāo)準(zhǔn)）及小花脫落的變化過(guò)程。

1.2.2 花粉活力測(cè)定方法①花粉采集。采集即將散粉期、散粉初期、散粉盛期、散粉末期4個(gè)時(shí)期的雄花序。將各時(shí)期雄花序平攤在硫酸紙上，將已經(jīng)散出的花粉收集，花序置避風(fēng)陽(yáng)光下晾曬，每隔半小時(shí)收集1次花粉。收集的花粉用100目篩子過(guò)篩去除雜質(zhì)。②花粉保存。4個(gè)散粉時(shí)期花粉保存：常溫干燥保存，每天測(cè)花粉活力。不同儲(chǔ)藏條件下花粉保存：將薄殼山核桃散粉盛期的花粉隨機(jī)分成6份，裝入密封袋內(nèi)，置于常溫密封、常溫密封干燥；4℃低溫密封和4℃低溫密封干燥；-70℃超低溫密封和-70℃超低溫密封干燥內(nèi)（干燥條件即在密封袋內(nèi)裝入500 g變色硅膠）。儲(chǔ)藏2，4，6，8，10，30，50，70，90，120，360 d后測(cè)各組的花粉活力。③花粉活力測(cè)定方法（FCR熒光染色法）［7-8］。a.配制母液1（SS1）：1.75 mol·L-1蔗糖，3.32 mmol·L-1硼酸，3.05 mmol·L-1硝酸鈣，3.33 mmol·L-1硫酸鎂，1.98 mmol·L-1硝酸鉀，蒸餾水定容后，置4℃低溫保存?zhèn)溆谩Ａ硗?，為了避免由滲透壓引起的花粉破裂，可以適當(dāng)增加蔗糖濃度，還可以通過(guò)增加鹽的濃度增強(qiáng)熒光效果。b.配制母液2（SS2）：把雙乙酸熒光素溶于丙酮中，配成濃度為7.21 mmol·L-1后，置棕色玻璃瓶，4℃低溫保存?zhèn)溆?。c.工作液：使用時(shí)，取8～12滴SS2于10mL SS1中，混勻直到混合液變?yōu)檩p乳狀即為工作液。操作時(shí)，取2～3滴工作液滴于花粉上，蓋上蓋玻片，2min后置熒光顯微鏡下觀察。重復(fù)3次·處理-1，觀察5個(gè)視野·重復(fù)-1，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野內(nèi)花粉顆?？倲?shù)（明場(chǎng)光照下）和被熒光染色花粉顆粒總數(shù)。④花粉活力計(jì)算方法：有生活力花粉百分?jǐn)?shù)=（視野內(nèi)變綠色花粉顆粒數(shù)目/視野內(nèi)花粉顆?？倲?shù)）×100%。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理方法試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007計(jì)算和分析，對(duì)百分率數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦平方根轉(zhuǎn)換，其獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和方差分析處理均采用SPSS 18.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，多重比較采用Duncan修復(fù)極差法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1雄蕊開花習(xí)性

‘馬漢’為典型雌蕊先熟型品種，雄花芽于3月中旬開始萌動(dòng)，經(jīng)9～12 d后芽開始綻開，芽綻開后長(zhǎng)出3束葇荑花序，花序直挺，0.5～1.1 cm左右，斜上生長(zhǎng)，此為初花期。4月中旬花序伸長(zhǎng)，開始軟垂，雄花序迅速伸長(zhǎng)，小花形成，并由深綠色變成淺綠色。4月下旬，花苞開放，花藥發(fā)育，每個(gè)花序由114～126朵小花組成。

圖1 薄殼山核桃散粉期雄花所處發(fā)育狀態(tài)比例Figure 1 Ratio ofmale flowers during four developmentstages

雄蕊散粉期經(jīng)過(guò)花萼開裂→即將散粉期（花藥由綠變黃）→散粉初期（25%小花花藥開裂）→散粉盛期（50%以上小花花藥開裂）→散粉末期（花藥完全開裂，花序變黑，花粉基本散盡）→小花脫落的變化過(guò)程。雄蕊散粉周期短，且發(fā)育進(jìn)程不一致。如圖1所示，5月6日花藥由綠變黃，占雄花比例的95.22%。此后，散粉雄花序比列逐漸增大，雄蕊進(jìn)入散粉期。5月7日，散粉初期花序占44.79%，散粉盛期花序占11.90%，進(jìn)入散粉的雄花序占到56.69%比例。5月8日，各散粉期比例呈明顯正態(tài)分布，散粉盛期花序比例增大，占46.60%，散粉比例達(dá)到75.29%，此時(shí)進(jìn)入散粉盛期。5月9日，即將散粉期花序僅有4.57%，散粉盛期比例最大，達(dá)52.09%。5月10日，雄蕊進(jìn)入散粉末期，比例為80.57%。散粉后，小花枯萎脫落，進(jìn)入落花期。

2.2 不同散粉期花粉活力

如表1和表2所示：不同散粉期花粉生活力差異顯著，各時(shí)期花粉的耐儲(chǔ)藏性也差異顯著，表現(xiàn)為即將散粉期＞散粉初期＞散粉盛期＞散粉末期。在整個(gè)散粉過(guò)程中，即將散粉期和散粉初期花粉活力最高，達(dá)到90%以上，兩者之間無(wú)顯著性差異；散粉盛期花粉活力次之，花粉活力為88.39%；散粉末期花粉活力最差，僅為79.60%，與花藥黃色時(shí)期和散粉初期差異顯著。將4個(gè)時(shí)期的花粉在常溫干燥條件下儲(chǔ)藏，進(jìn)行花粉活力比較（圖2），發(fā)現(xiàn)花藥黃色時(shí)期花粉活力下降最慢，與其他3個(gè)時(shí)期的花粉相比更耐儲(chǔ)藏，4 d之后花粉活力僅下降24.00%；散粉初期和散粉盛期花粉活力下降次之，兩者之間無(wú)顯著性差異，4 d后分別下降41.89%和44.11%，但與黃色花藥時(shí)期差異顯著；散粉末期花粉活力下降最快，4 d之后花粉下降74.00%，與之前3個(gè)時(shí)期花粉儲(chǔ)藏活力達(dá)到極顯著差異。

表1 薄殼山核桃散粉期花粉生活力Table 1 Pollen viability of pecan during pollination

表2 散粉期花粉活力方差分析Table 2 Comparison of pollen viability during pollination

2.3 不同儲(chǔ)藏條件下花粉活力

花粉散落后，其內(nèi)部就開始發(fā)生一系列的生理代謝反應(yīng)，活力逐漸衰退。隨儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，花粉活力有明顯下降趨勢(shì)。由圖2表明：不同溫度處理下花粉活力-70℃超低溫＞4℃低溫＞常溫儲(chǔ)藏（圖3），在常溫、低溫、超低溫儲(chǔ)藏條件下花粉活力下降呈顯著性差異（表3和圖4）。在常溫條件下花粉儲(chǔ)藏時(shí)間最短。常溫儲(chǔ)藏4 d后花粉活力為66.34%，下降29.14%，10 d后下降69.25%，30 d之后花粉活力下降到7.08%，50 d后花粉已經(jīng)完全喪失活力；在常溫密封干燥條件下花粉活力下降趨勢(shì)與常溫密封下無(wú)顯著性差異，10 d后，花粉活力下降59.95%，50 d后花粉也已經(jīng)完全喪失活力。而4℃低溫條件下花粉活力儲(chǔ)藏時(shí)間比常溫儲(chǔ)藏時(shí)間更長(zhǎng)，低溫密封儲(chǔ)藏4 d后花粉活力為71.04%，下降24.22%，與常溫密封條件下花粉活力差異顯著，10 d后下降39.03%，30 d后下降57.83%，90 d之后花粉活力下降到10.09%，120 d后花粉已經(jīng)完全喪失活力；低溫密封干燥與低溫密封保存無(wú)顯著性差異，120 d后花粉也完全喪失活力。-70℃超低溫條件下保存效果最好，與常溫、低溫差異極顯著，儲(chǔ)藏50 d花粉活力仍有70.40%，僅下降24.91%，儲(chǔ)藏120 d花粉活力下降36.62%，儲(chǔ)藏360 d花粉活力還保持43.55%的活力，-70℃密封干燥要優(yōu)于-70℃密封儲(chǔ)藏，但差異也不顯著，兩者分別下降了53.55%和47.43%。

3 討論

在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，為了進(jìn)行人工輔助授粉或雜交授粉育種，需要早期采集花粉和儲(chǔ)藏花粉，并對(duì)花粉活力進(jìn)行檢測(cè)［9-11］。花粉的采集時(shí)間是影響花粉活力的一個(gè)重要的因素。采集過(guò)早，花粉未完全發(fā)育,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累不夠充分，花粉少且活力低；采集時(shí)間過(guò)遲，則花多已散粉，影響花粉采集量［12］。作者參考曲柏宏等［13］通過(guò)花期物候觀察確定花粉成熟期，利用熒光染色反應(yīng)（FCR）測(cè)定各散粉期花粉活力。研究結(jié)果表明：不同散粉期采集的花粉生活力差異顯著，從而確定最佳采粉時(shí)間是即將散粉期（花藥由綠變黃時(shí)期）。作者認(rèn)為，在即將散粉期，花粉粒已經(jīng)發(fā)育完全，而且花粉粒仍處于花粉囊中，避免花粉與空氣接觸而導(dǎo)致花粉活力降低，所以相比較散粉期的花粉更有利于運(yùn)輸和保存，但這有待于進(jìn)一步研究。

圖2 不同儲(chǔ)藏條件下花粉活力比較Figure 2 Comparison of pollen viability under different storage conditions

表3 不同儲(chǔ)藏條件下花粉活力方差分析Table 3 Variance analysisof pollen viability under differentstorage conditions

圖3 儲(chǔ)藏4 d后4個(gè)散粉期花粉活力對(duì)比Figure 3 Pollen vitality of four storage period after storing four days

圖4 儲(chǔ)藏6 d花粉活力對(duì)比Figure 4 pollen vitality of four storage period after storing six days

溫度是影響花粉儲(chǔ)藏活力的重要因素［14-16］，低溫能明顯阻止花粉的衰老，主要原因是降低了呼吸強(qiáng)度和酶的活性［17］。通過(guò)研究表明：不同儲(chǔ)藏條件對(duì)薄殼山核桃花粉活力有顯著影響，這與許多研究結(jié)果一致，而且溫度與花粉儲(chǔ)藏壽命呈負(fù)相關(guān)［18］。在室溫條件下，儲(chǔ)藏4 d花粉活力下降了30.00%，儲(chǔ)藏10 d就下降了70.00%。此方法儲(chǔ)藏時(shí)間短，所以在生產(chǎn)實(shí)踐上只能短期應(yīng)用。在4℃低溫條件下，儲(chǔ)藏30 d花粉活力下降58.00%，儲(chǔ)藏90 d花粉活力下降90.00%，在一般生產(chǎn)實(shí)踐上低溫保存能夠應(yīng)付花期不遇和雜交授粉等問(wèn)題。在-70℃超低溫條件下保存1 a，花粉活力還能達(dá)到50.00%，可以用作來(lái)年的輔助授粉工作或應(yīng)對(duì)散粉期陰雨天氣。近年來(lái)，由于應(yīng)用了超低溫和冷凍干燥技術(shù)保存花粉，使花粉儲(chǔ)藏壽命大幅度延長(zhǎng)［19］，為雜交育種、種質(zhì)資源的保存提供了有力支持。

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Flowering characteristicsand pollen viability of Carya illinoensis‘Mahan’

YANG Xianyu1,HUANG Jianqin1,XU Kuiyuan2,XIA Guohua1,YUAN Ziqian1,3,
LING Hua1,WANG Zhengjia1
（1.The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.Forest Enterprise of Jiande City,Jiande 311600,Zhejiang,China;3.Hangzhou Academy of Forestry,Hangzhou 310016,Zhejiang,China）

To promote collection and the effective conservation ofCarya illinoensis（pecan）pollen,male flowering habits and pollen vigor in four developmental stageswith different storage conditions［a）room temperature,b）room temperature and dry,c）4℃,d）4℃and dry,e）-70℃,and f）-70℃and dry］were observed using the fluorochromatic reaction（FCR）method.Results showed that on April 26th the bract in the catkins had cracked.By May 6th the anthers had turned from green to yellow;between May 7th and 9th,the pollen sac split shedding catkin pollen.As of May 8th about 75%of the shedding had occurred,and on May 10th when the catkins turned brown and fell from the trees,shedding was complete.The sequence for pollen viability was beginning of shedding＞early shedding＞heavy shedding＞final shedding with storage durability for the pollen having the same order.Pollen viability for different storage conditions followed decay curves,butdifferences were noted with-70℃and dry＞-70℃＞4℃and dry＞4℃＞room temperature and dry＞room temperature.Also,as storage time increased,pollen viability gradually decreased.The fastest decline in pollen viability was at room temperature,and after 50 d the pollen had completely lost its vitality.When stored at4°C, the pollen had mostly lost its vitality after 120 d.The best condition was preservation at-70℃where pollen was still 43.55%viable after 360 d.［Ch,4 fig.3 tab.19 ref.］

cash forestry；Carya illinoensis‘Mahan’；catkin development；pollen viability；storage conditions；fluorochromatic reaction（FCR）

S722.1；S664.1

A

2095-0756（2014）04-0528-06

2013-09-24；

2013-11-13

浙江省科學(xué)技術(shù)重大國(guó)際科技合作資助項(xiàng)目（2011C14010）；杭州市科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（20130432B85）；浙江農(nóng)林大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目（3122013240216）

楊先裕，從事經(jīng)濟(jì)林栽培與利用。E-mail：hkyangxianyu6698@163.com。通信作者：王正加，教授，博士，從事林木遺傳育種研究。E-mail：wzj@zafu.edu.cn