尿液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)對(duì)腎結(jié)核的診斷價(jià)值

李影　張東浩

【摘要】 目的 探討尿液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)在腎結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 對(duì)108例已確診為腎結(jié)核的患者尿液標(biāo)本分別采取抗酸菌涂片染色、改良羅氏培養(yǎng)、熒光定量PCR三種方法進(jìn)行檢測(cè)， 其結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果 抗酸菌涂片染色、改良羅氏培養(yǎng)、熒光定量PCR檢測(cè)尿液中結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性率分別為25.9%、51.9%、72.2%。結(jié)論 尿液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)屬病原學(xué)檢測(cè)， 特異性好、操作簡(jiǎn)便， 對(duì)腎結(jié)核的診斷有著重要的應(yīng)用價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 尿液；結(jié)核分枝桿菌；腎結(jié)核；診斷

結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一， 據(jù)WHO估計(jì)， 全球有約20億人感人結(jié)核分枝桿菌， 每年有約200萬(wàn)人死于結(jié)核病[1]。近年來(lái)， 隨著結(jié)核病發(fā)病率在全球范圍內(nèi)的回升， 腎結(jié)核的發(fā)病率也明顯增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)， 全球每年有近千萬(wàn)人感染結(jié)核病， 而腎結(jié)核約占其中的8%～20%。該病進(jìn)展隱蔽， 發(fā)現(xiàn)時(shí)， 腎功能已部分或完全喪失， 患者早期診斷困難， 以致延誤治療， 對(duì)人們的身體健康危害極大。因此早診斷對(duì)治療尤為重要。在眾多輔助檢查中， 除病理診斷外， 實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢查具有較高的特異性， 且操作簡(jiǎn)便， 患者無(wú)痛苦。現(xiàn)就最常用的抗酸菌涂片染色、改良羅氏培養(yǎng)、熒光定量PCR三種檢測(cè)方法進(jìn)行分析， 評(píng)價(jià)其在尿液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)對(duì)腎結(jié)核診斷的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 2010年11月～2013年10月本院住院的腎結(jié)核患者， 共計(jì)108例。男性58例， 女性50例。其中小于20歲者7例， 大于40歲者27例， 20～40歲者74例， 占68.5%；單側(cè)腎結(jié)核87例， 雙側(cè)腎結(jié)核21例；合并其他臟器結(jié)核病（如肺結(jié)核、脊柱結(jié)核、腸結(jié)核、附睪結(jié)核等）65例， 約占60.2%。

1. 2 標(biāo)本收集

1. 2. 1 抗酸菌涂片染色檢測(cè) 留取12 h尿液， 靜置， 傾去上清液， 留取沉淀部分30 ml， 以3000 rpm離心30 min， 棄上清， 取沉淀物涂片。

1. 2. 2 改良羅氏培養(yǎng)和熒光定量PCR檢測(cè) 囑患者留取晨尿， 因晨尿濃縮， 適用于做病原學(xué)檢查。在留取尿液之前先用消毒液清洗外陰， 以去除污染菌。分別留取中段尿約20～30 ml于一次性無(wú)菌塑料標(biāo)本杯中各一杯。為提高檢出率， 所有患者均連續(xù)留取3 d標(biāo)本， 置于2～8℃冰箱中貯存， 于3 d后將尿液混合進(jìn)行改良羅氏培養(yǎng)和熒光定量PCR檢測(cè)。如患者正在進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療時(shí)， 應(yīng)停用所有抗結(jié)核藥一周， 以提高結(jié)核桿菌的檢出率。

1. 3 試劑與儀器

1. 3. 1 抗酸菌涂片染色 試劑由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。無(wú)需特殊儀器。

1. 3. 2 羅氏培養(yǎng) 改良酸性羅氏培養(yǎng)基由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。隔水式培養(yǎng)箱由天津市泰斯特儀器有限公司提供。

1. 3. 3 熒光定量PCR 由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供試劑。儀器LightCycler 3.5全自動(dòng)熒光定量基因擴(kuò)增儀由羅氏公司提供。

1. 4 方法

1. 4. 1 抗酸菌涂片染色 取制備好的尿沉淀物0.05～0.10 ml均勻涂于玻片上， 直徑約2～3 cm， 火焰固定。滴加石碳酸復(fù)紅染液布滿(mǎn)標(biāo)本， 保持3～5 min。流水自玻片一端沖洗洗去染液， 瀝干剩余水分。滴加3%的鹽酸酒精， 1～3 min后流水沖洗瀝干。滴加美藍(lán)染液， 0.5～1 min后流水沖洗瀝干。置于干燥箱中干燥后鏡檢。

1. 4. 2 改良羅氏培養(yǎng) 將標(biāo)本進(jìn)行離心， 以2000 rpm/min離心3 min為宜， 取離心沉淀后的尿沉渣標(biāo)本0.1～0.3 ml， 以無(wú)菌操作接種于培養(yǎng)基斜面上， 一般每份標(biāo)本同時(shí)接種2支培養(yǎng)管。將接種好的培養(yǎng)管置于35～37℃培養(yǎng)箱中孵育， 5%～10%的CO2可以促進(jìn)分枝桿菌的生長(zhǎng)， 培養(yǎng)管須松蓋傾斜放置24 h后再將蓋子鎖緊， 垂直放置。接種并孵育第一周需每天判讀一次菌落生長(zhǎng)情況。此后每周判讀一次， 記錄菌落生長(zhǎng)及污染情況。判讀如發(fā)現(xiàn)斜面培養(yǎng)基上有菌落出現(xiàn)， 須挑取菌落做成涂片進(jìn)行抗酸染色鏡檢。

1. 4. 3 熒光定量PCR 取底部尿液標(biāo)本10～15 ml離心管中15000 rpm離心5 min。去上清， 沉淀加無(wú)菌生理鹽水1 ml打勻， 15000 rpm離心5 min， 去上清。加50 μl DNA提取液充分混勻， 100℃浴溫10 min， 待自然冷卻后， 10000 rpm離心5 min， 取上清液2 μl加入專(zhuān)用毛細(xì)管中4000 rpm離心3 min， 插入圓形卡盤(pán)倒置20 s后放入儀器中進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。步驟為：93℃→2 min預(yù)變性， 然后按照93℃5 s→57℃45 s， 做40個(gè)循環(huán)， 最后置37℃延伸1 s。整個(gè)過(guò)程嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作， 擴(kuò)增及結(jié)果判讀， 由電腦自動(dòng)完成。

2 結(jié)果

三種方法檢測(cè)尿液結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性檢出率分別為抗酸菌涂片染色法25.9%（28/108）， 改良羅氏培養(yǎng)法51.9%（56/108）， 熒光定量PCR法72.2%（78/108）。

3 討論

近年來(lái)臨床不典型腎結(jié)核發(fā)病率有增加的趨勢(shì)[2]， 此外， 超過(guò)1/2的腎結(jié)核患者伴有全身其他部位的結(jié)核菌感染， 所以發(fā)現(xiàn)全身其他部位的結(jié)核病灶時(shí)， 應(yīng)進(jìn)行全面檢查是否存在腎結(jié)核等結(jié)核性疾病， 而全身其他部位的結(jié)核病灶也支持腎結(jié)核的診斷。

在腎結(jié)核的診斷方法中， 主要為影像學(xué)檢查和病原學(xué)檢查。影像學(xué)檢查中， B超檢查對(duì)早期腎結(jié)核的診斷意義不大， 只適合腎結(jié)核初篩和治療后的復(fù)查[3]。IVU或CT的典型表現(xiàn)對(duì)中晚期腎結(jié)核具有確診價(jià)值[4]。因此， 病原學(xué)檢查對(duì)腎結(jié)核的早期診斷尤為重要。

抗酸菌涂片染色檢查是實(shí)驗(yàn)室最基本的細(xì)菌學(xué)檢查方法。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、快速， 無(wú)需任何設(shè)備， 廉價(jià)， 1～2 h即可回報(bào)結(jié)果， 對(duì)結(jié)核病早期診斷和病程的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸起著重要作用；缺點(diǎn)是受人為因素影響大， 靈敏度低， 檢出率一般只有25%～28%。通常需5000～10000條菌/ml才能得到陽(yáng)性結(jié)果。endprint

改良羅氏培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高， 不易被污染， 特異性好， 操作簡(jiǎn)便， 無(wú)需特殊儀器設(shè)備， 并可結(jié)核抗酸菌涂片檢測(cè)來(lái)鑒定死菌與活菌， 還可以進(jìn)一步藥物敏感性的鑒定， 為臨床用藥提供可靠依據(jù)， 被譽(yù)為結(jié)核病診斷的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”；缺點(diǎn)是費(fèi)用高， 操作流程長(zhǎng)， 通常需6～8周才能獲得結(jié)果。

熒光定量PCR是一種密閉的擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)， 所檢測(cè)的是結(jié)核分枝桿菌的特異DNA片段， 具有敏感度、特異度高及方便快速、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)， 特別是對(duì)難以培養(yǎng)與生長(zhǎng)緩慢的結(jié)核桿菌的檢測(cè)更有優(yōu)勢(shì)[5]。只需極少量的病原標(biāo)本， 即可及時(shí)準(zhǔn)確的判定結(jié)果。陽(yáng)性下限僅為10個(gè)拷貝/ml， 操作簡(jiǎn)單， 只需2～3 h即可完成。缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求極高（需按照相關(guān)法律法規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室并提交主管部門(mén)審批合格）， 因其檢出率高， 故而極微量的污染就可能造成假陽(yáng)性結(jié)果。因此需聯(lián)合多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查可以提高腎結(jié)核診斷的特異性和敏感性。

綜上所述， 尿液結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)是診斷腎結(jié)核的關(guān)鍵， 且尿標(biāo)本簡(jiǎn)單易取， 取樣不會(huì)給患者帶來(lái)痛苦和增加感染機(jī)會(huì)， 特異性好， 靈敏度較高， 對(duì)腎結(jié)核的早期診斷有明顯的優(yōu)勢(shì)。因此， 不難看出尿液結(jié)核分枝桿菌檢查對(duì)臨床腎結(jié)核以致泌尿系結(jié)核的診斷具有無(wú)可替代的重要作用。

雖然尿液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)對(duì)腎結(jié)核的診斷發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用， 但其檢測(cè)方法的的靈敏度和特異性還有待進(jìn)一步提高， 且易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性。因此， 完整的腎結(jié)核診斷仍然需要將病史、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、影像學(xué)分析、病理學(xué)診斷等方法相結(jié)合進(jìn)行綜合分析， 才能提高腎結(jié)核早期診斷率， 為進(jìn)一步的正規(guī)抗結(jié)核治療贏得時(shí)機(jī)。

參考文獻(xiàn)

[1] 張瑛，孫亞蒙，徐欣暉，等.結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)再結(jié)核性疾病中的診斷價(jià)值.中華臨床醫(yī)師雜志（電子版）， 2010， 12（4）：2431-2434.

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