正交試驗(yàn)法優(yōu)化南五味子木脂素提取工藝

黃 瑩， 夏 恒

(1.武漢市漢口醫(yī)院 藥劑科，湖北 武漢 430012；2.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510080)

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正交試驗(yàn)法優(yōu)化南五味子木脂素提取工藝

黃 瑩1， 夏 恒2

(1.武漢市漢口醫(yī)院 藥劑科，湖北 武漢 430012；2.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510080)

目的：篩選乙醇回流法提取南五味子木脂素的最佳工藝。方法：采用正交試驗(yàn)法，以五味子醇甲、五味子甲素、干浸膏含量為指標(biāo)，考察提取溶劑、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)提取工藝的影響，優(yōu)選最佳提取工藝。結(jié)果：最佳工藝為90%乙醇提取1次，提取時(shí)間為1.5h，料液比為1∶8。結(jié)論：該工藝操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

木脂素；正交試驗(yàn)；含量測(cè)定

南五味子為木蘭科植物華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果實(shí)，其性酸，味甘、溫，歸肺、心、腎經(jīng)，為中醫(yī)臨床常用潤(rùn)肺、滋腎、止汗、止瀉、澀精藥，主治咳喘、自汗、盜汗、遺精、久瀉、神經(jīng)衰弱等癥，臨床應(yīng)用廣泛[1-2]。南五味子種子中含有五味子甲素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、乙、丙、丁、戊等木脂素類成分。近年來，高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定五味子及其制劑中有效成分的研究報(bào)道較多，多集中在單個(gè)成分的測(cè)定上，兩個(gè)及以上成分同時(shí)測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究?jī)?yōu)選五味子有效成分的提取工藝，對(duì)高效液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)定樣品中五味子醇甲和五味子甲素的含量，結(jié)果表明該法快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為五味子的質(zhì)量控制和開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試藥與試劑

南五味子(批號(hào)130201，產(chǎn)地：湖南，廣州至信中藥飲片有限公司)；五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：110857-201211)、五味子甲素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：110764-201111)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；水為蒸餾水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

Waters1525泵高效液相色譜儀(Waters公司)；DS-II型電熱三用水箱(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)；101-1-BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；BS423S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)； SHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52-99(上海亞榮生化儀器廠)；WS70-1型紅外快速干燥器(上海浦東躍欣科學(xué)化工廠)；真空干燥器。

2 方法

2.1 色譜條件

BondapakTM C18色譜柱(3.9mm×300mm，5μm)，以甲醇為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，流速為1mL/min，柱溫為25℃。測(cè)定五味子醇甲的流動(dòng)相比例為甲醇∶水=55∶45，測(cè)定五味子甲素的流動(dòng)相比例為甲醇∶水=65∶35，理論塔板數(shù)按五味子醇甲計(jì)算應(yīng)不低于2 000。五味子醇甲和五味子甲素的出峰時(shí)間分別為9.4min和14.8min，如圖1所示。

圖1 五味子木脂素色譜

2.2 對(duì)照品溶液制備

取五味子醇甲和五味子甲素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1mL含五味子醇甲0.388mg、五味子甲素0.305mg的對(duì)照品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別取五味子醇甲和五味子甲素對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，進(jìn)樣體積分別為3μL、5μL、10μL、15μL、20μL，記錄色譜圖，分別以對(duì)照品五味子醇甲、五味子甲素含量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程分別為：五味子醇甲：Y=328.1X-15.24(r=0.998)；五味子甲素：Y=268.3X-6.966(r=0.999)，表明五味子醇甲和五味子甲素分別在1.164～7.760μg、0.915～6.100μg進(jìn)樣量范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.4 樣品溶液制備

稱取南五味子15g，參考袁海龍[3]、王茹[4]等關(guān)于五味子甲素及五味子醇甲的最優(yōu)提取條件篩選方法，按乙醇濃度90%，回流時(shí)間1h，提取次數(shù)2次，料液比1∶10的條件進(jìn)行回流提取、濾過，合并濾液，減壓回收乙醇并轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為樣品溶液。

2.5 供試品溶液制備

精密吸取樣品溶液20mL，蒸干，殘?jiān)蒙倭考状汲暼芙?，并轉(zhuǎn)移到10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。按“2.1”色譜條件下分別測(cè)定五味子醇甲和五味子甲素的峰面積，計(jì)算正交試驗(yàn)下提取所得的五味子醇甲和五味子甲素含量。

2.6 干浸膏含量測(cè)定

精密量取樣品溶液20mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上蒸干，于105℃下干燥至恒重，冷卻，精密稱定重量，計(jì)算浸出物含量。

2.7 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將南五味子按照不同濃度乙醇(0%、40%、80%、95%)，提取料液比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12)，提取次數(shù)(1、2、3、4次)，提取時(shí)間(0.5、1、1.5、2h)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

2.8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果，以乙醇濃度、提取料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為研究對(duì)象，以五味子醇甲、五味子甲素總含量及干浸膏含量2個(gè)為研究指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝參數(shù)，見表1。

表1 因素水平

3 結(jié)果

3.1 五味子木脂素測(cè)定條件優(yōu)選結(jié)果

3.1.1 乙醇濃度選擇 當(dāng)乙醇濃度為0時(shí)，五味子甲素沒有出峰，僅測(cè)得五味子醇甲的峰面積。由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增大，五味子醇甲和五味子甲素的含量也隨之升高，當(dāng)達(dá)到95%時(shí)，其含量有下降趨勢(shì)，因此，乙醇濃度應(yīng)以80%為宜。

3.1.2 料液比選擇 由圖3可知，提取溶劑體積與中藥材質(zhì)量比越大，測(cè)得五味子醇甲和五味子甲素的含量也越高。當(dāng)料液比達(dá)到1∶8時(shí)，兩者含量增長(zhǎng)呈現(xiàn)平緩趨勢(shì)，故最佳料液比應(yīng)選擇1∶8。

3.1.3 提取次數(shù)選擇 由圖4可知，當(dāng)采用乙醇連續(xù)提取2次后，總木脂素含量增長(zhǎng)平緩，說明經(jīng)過2次提取，已經(jīng)基本將五味子中的木脂素醇甲和木脂素甲醇提取出來。因此，應(yīng)選擇提取2次為宜。

3.1.4 提取時(shí)間選擇 由圖5可知，總木脂素含量在提取時(shí)間為30～120min區(qū)間內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60min后，木脂素含量增長(zhǎng)幅度不甚明顯，因此綜合考慮選擇提取時(shí)間為60min。

3.2 五味子木脂素含量測(cè)定工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果，以乙醇濃度、提取料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)為研究對(duì)象，以五味子醇甲、五味子甲素及干浸膏含量為研究指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)L9(34)，確定最佳提取工藝參數(shù)，因素水平見表1。取南五味子15g進(jìn)行回流提取，并合并提取液，定容至500mL量瓶中。按“2.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并進(jìn)行含量測(cè)定，經(jīng)過直觀分析和方差分析，結(jié)果見表2和表3。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)號(hào)ABCD五味子總木脂素含量(mg/g)總固體(g)綜合指標(biāo)(%)111110.25170.102424.79212220.60430.103136.44313332.14400.123690.10421232.33680.101192.76522310.73690.120043.51623120.19840.099122.52731320.35950.096627.38832132.44690.079492.85933210.56140.091733.18K150.44348.31046.72033.827K252.93057.60054.12728.780K351.13748.60053.66391.903R2.4879.2907.40763.123

注：五味子總木脂素(mg/g)=五味子醇甲含量+五味子甲素含量。

綜合評(píng)分(%)=(五味子總木脂素含量/最高含量)*100%* 0.8+(總固體/最高含量)*100%* 0.2。

表3 正交設(shè)計(jì)方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00,*P<0.05。

直觀分析表明，影響南五味子木脂素提取的主要因素為提取時(shí)間，其次是提取料液比和提取次數(shù)，即各因素的影響程度大小依次為D>B>C>A。方差分析表明，提取時(shí)間對(duì)提取工藝有顯著影響。故最終選定最佳工藝為A3B2C1D3，即90%乙醇，料液比為1∶8，提取1次，提取時(shí)間為1.5h。

3.3 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按照最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，稱取南五味子15g，以8倍量90%乙醇加熱回流提取1次，提取1.5h。平行3次試驗(yàn)，結(jié)果測(cè)得五味子兩種木脂素含量和分別為2.465 0mg/g、2.438 9mg/g和2.403 9mg/g。結(jié)果表明該優(yōu)選工藝穩(wěn)定可行。

4 討論

文獻(xiàn)中五味子總木脂素的含量測(cè)定指標(biāo)包括五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素等，由于本實(shí)驗(yàn)是以南五味子為提取對(duì)象，而南五味子中不含有五味子乙素，因此選取的指標(biāo)為五味子醇甲和五味子甲素。在測(cè)定過程中筆者發(fā)現(xiàn)南五味子中五味子醇甲的含量明顯高于五味子甲素。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)期間，筆者對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)(216～254nm)和流動(dòng)相比例(甲醇∶水=55∶45～80∶20)進(jìn)行了篩選，并最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，五味子醇甲的流動(dòng)相比例為55∶45，出峰時(shí)間為9.4min，五味子乙素的流動(dòng)比例為65∶35，出峰時(shí)間為14.8min。之所以沒有選擇梯度洗脫，是因?yàn)槲逦蹲哟技壮龇宸秶^寬，在不同檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相比例均能出峰，只有流動(dòng)比例在55∶45時(shí)，五味子醇甲才能較好地與雜質(zhì)峰分開。同時(shí)五味子乙素在流動(dòng)相比例為55∶45的條件沒有峰出現(xiàn)，因此本實(shí)驗(yàn)采用兩次等度洗脫。

綜上所述，該工藝操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，可用于木脂素的工業(yè)化生產(chǎn)。

[1] 李安金,耿加利.五味子藥理作用研究概況[J].中華綜合臨床醫(yī)學(xué)雜志,2004(4):117-119．

[2] 李曉光,高勤.五味子有效部位及其藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥材，2005,28(2):156-159．

[3] 袁海龍,譚銳,李仙逸,等.均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選五味子的提取工藝[J].中國(guó)中藥雜志,2002,27(5):355-358.

[4] 王茹,張琰,程建峰,等.五味子活性成分提取工藝的優(yōu)選[J].華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2005,19(6):4-6.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Orthogonal Experiment Method to Optimize the Extraction Process of Lignans in Schisandra Chinensis

Huang ying1，Xia heng2

(1.Pharmacy department of Wuhan Hankou Hospital, Wuhan 430012,China;2.College of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510080,China)

Objective:To screen the optimum process of ethanol reflux extraction of Lignans in Schisandra chinensis. Methods:Using the orthogonal experiment to test the effects of extraction solvent, material liquid ratio, extraction time, extraction times on extraction process, with the index of Schizandrin, Deoxyschizandrin and dry extract content, then optimized the best extraction process. Results:The optimum technology was 90% ethanol extraction, extraction time 1.5 h, and solid-liquid ratio of 1∶8. Conclusion:The process can be used for industrialized production, with simple operation and good stability.

Lignans; Orthogonal Experiment; Content Determination

2014-05-22

黃瑩(1977-)，女，武漢市漢口醫(yī)院主管藥師 ，研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)。

R284.2

A

1673-2197(2014)18-0014-03