跳骨片中馬兜鈴酸A的限量測(cè)定

林武俊，陳小玉，劉可福

(1.福州屏山制藥有限公司，福建 福州 350007；2.福建中正藥業(yè)有限公司，福建福州 350004；3.福建省汀州醫(yī)院 ，福建 長(zhǎng)汀 366300)

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跳骨片中馬兜鈴酸A的限量測(cè)定

林武俊1，陳小玉2，劉可福3

(1.福州屏山制藥有限公司，福建 福州 350007；2.福建中正藥業(yè)有限公司，福建福州 350004；3.福建省汀州醫(yī)院 ，福建 長(zhǎng)汀 366300)

目的：研究跳骨片中馬兜鈴酸A的限量測(cè)定方法。方法：色譜柱為Shimpack Vp-ods (4.6mm×15cm)C18柱,流動(dòng)相為: 甲醇-1%冰醋酸(51∶49);流速:1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。結(jié)果：進(jìn)樣量在20.04～1 282.5ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系(r=0.999 98);平均回收率為98.50%,RSD為0.74%(n=6)。經(jīng)HPLC含量測(cè)定，其馬兜鈴酸A的含量極低(2～20μg·g-1)。對(duì)10批成品進(jìn)行檢測(cè)，其含量均小于20ppm，參照ICH對(duì)氯仿殘留的限定，濃度限定<60ppm,PED<0.6mg/d,本產(chǎn)品馬兜鈴酸A含量低于該限度。結(jié)論：該法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確,結(jié)果可靠，可用于測(cè)定跳骨片中馬兜鈴酸A的限量。

馬兜鈴酸A； 跳骨片；高效液相色譜法；限量測(cè)定

跳骨片為我公司主要中藥制劑，為骨傷科驗(yàn)方，臨床沿用百余年，療效確切，使用過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。本品處方中含有細(xì)辛，細(xì)辛為馬兜鈴科植物，細(xì)辛中含有微量馬兜鈴酸[1-4]，為保證用藥安全，擬對(duì)投料所生產(chǎn)的跳骨片進(jìn)行研究，建立馬兜鈴酸A的HPLC限量測(cè)定檢查法。

1 儀器及試藥

日本島津LC-10AVP高效液相色譜儀，甲醇為色譜純，其它試劑為分析純，水為超純水；馬兜鈴酸A對(duì)照品為中國(guó)食品藥品生物制品檢定研究院提供,批號(hào)：110746-200406；跳骨片為福州屏山制藥有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shimpack Vp-ODS(4.6mm×15cm)C18。流動(dòng)相：甲醇-1%冰醋酸(51∶49)，流速1mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。理論塔板數(shù)按馬兜鈴酸A峰計(jì)不低于2 000。其分離度大于1.5。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取馬兜鈴酸A對(duì)照品12.83mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1mL，置100mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(每lmL中含馬兜鈴酸5.13μg)。與樣品的馬兜鈴酸A濃度接近。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品40片，除去糖衣，研細(xì)，取8g，精密稱(chēng)定，置150mL錐形瓶中，精密加入10%甲酸丙酮100mL，密塞，精密稱(chēng)重，超聲處理40min，取出，精密稱(chēng)重，用10%甲酸丙酮補(bǔ)足損失的量，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液約5mL，精密吸取續(xù)濾液75mL，置水浴上蒸干，殘?jiān)?.1mol/L氫氧化鈉溶液25mL分次溶解，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加氯仿萃取3次，每次15mL，棄去氯仿溶液，收集堿水液加5mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH=2，加氯仿萃取4次，每次15mL，合并氯仿溶液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状挤执稳芙?，轉(zhuǎn)入5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。進(jìn)樣前用0.45μm濾膜濾過(guò)。作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照品溶液制備 取缺細(xì)辛的跳骨片陰性對(duì)照品，研細(xì)，精密稱(chēng)取8g，按供試品溶液的制備方法同法制備，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密吸取供試品溶液、陰性溶液、對(duì)照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰,結(jié)果陰性樣品對(duì)馬兜鈴酸A測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

取馬兜鈴酸A對(duì)照品溶液(0.513mg/mL)，用甲醇按梯度稀釋成128.25、64.125、32.063、16.031、8.016、4.008、2.004μg/mL,分別進(jìn)樣10μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積；以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),以相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=921.1X+254.9，r=0.999 98，表明進(jìn)樣量在20.04～1 282.5ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取樣品測(cè)定下對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定對(duì)照品溶液峰面積，求得峰面積平均值為42 542，峰面積值的RSD=0.56%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液(批號(hào)：131002)，在0、2、4、6、8h分別進(jìn)樣10μL，記錄馬兜鈴酸A的峰面積，結(jié)果表明，供試品溶液在8h內(nèi)較穩(wěn)定，其峰面積平均值為41 359,RSD=0.62%。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同批跳骨片樣品(批號(hào)：131002)，按供試品溶液制備方法操作，依含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定6次，計(jì)算含量，結(jié)果其馬兜鈴酸A的平均含量為4.285μg·g-1，RSD=0.73%(n=6)，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取32.063μg/mL對(duì)照品溶液1mL，置于三角瓶中，揮干溶劑，加入跳骨片細(xì)粉8g(批號(hào)：131002)，精密稱(chēng)定，按照供試品溶液的制備方法操作。按含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算回收率，平均回收率為98.50%，RSD值=0.74%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率結(jié)果

2.9 限量測(cè)定

取10批跳骨片樣品,除去糖衣，研細(xì)，取藥粉8g，精密稱(chēng)定，再按上述供試品溶液的制備方法同法制備，分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液10μL，按上述色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。由含量測(cè)定可知，每1g跳骨片中含有馬兜鈴酸的限量?jī)H為20ppm，參照ICH對(duì)氯仿殘留的限定，濃度限定<60ppm，PDE<0.6mg/d，跳骨片的馬兜鈴酸的含量低于該限度。

表2 跳骨片中馬兜鈴酸A的限量測(cè)定結(jié)果 (n=4)

3 討論

采用HPLC法測(cè)定跳骨片中馬兜鈴酸的限量，樣品在8h內(nèi)穩(wěn)定，RSD=0.62%，平均回收率為98．50%，RSD=0.74%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可作為跳骨片中馬兜鈴酸A限量測(cè)定方法。樣品的純化參考供試品制備方法，結(jié)果本法提取較為完全，系統(tǒng)誤差小。對(duì)甲醇-1%冰醋酸的比例進(jìn)行了對(duì)比性選擇實(shí)驗(yàn)，結(jié)果其比例為51∶49時(shí)，樣品分離度最好。馬兜鈴酸A是馬兜鈴屬植物的主要有效成分，為了避免馬兜鈴酸A引起的毒性反應(yīng)，使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格掌握劑量和用藥時(shí)間，避免超量或長(zhǎng)期服用。同時(shí)，對(duì)已生產(chǎn)的成藥中，需迅速補(bǔ)充和制定成藥中馬兜鈴酸A限量控制標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到用藥安全有效的目的。跳骨片中馬兜鈴酸A含量甚微，因此正常使用不致引起肝、腎損害。

[1] 吳艷蓉,賈凌云,高福坤,等.不同產(chǎn)地遼細(xì)辛中馬兜鈴酸的痕量檢測(cè)[J].中藥研究與信息,2005, 7(1):9-10.

[2] 姜旭,王智民,由麗雙,等.RP-HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地青木香和細(xì)辛中馬兜鈴酸A的含量[J].中國(guó)中藥雜志,2004,29(5):408-410.

[3] 關(guān)文秋,李曉蒙,肖佳尚.可逆高效液相色譜法測(cè)定細(xì)辛藥材及其制劑中馬兜鈴酸的含量[J].中國(guó)藥物與臨床,2005, 5(4):44-46.

[4] 謝昭明,李順祥,廖漢成.HPLC法測(cè)定細(xì)辛藥材中馬兜鈴酸A的含量[J].中南藥學(xué),2003,1(3):165-167.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

2014-01-17

林武俊(1966-)，男, 福建省福州屏山制藥有限公司主管藥師,研究方向?yàn)樗幬锓治龊托滤幯芯块_(kāi)發(fā)。

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