葉用芥菜小孢子離體培養(yǎng)條件

吳慧敏，何勇，邵泱峰，朱祝軍，符慶功

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點實驗室，浙江臨安 311300；2.浙江省臨安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江臨安 311300）

葉用芥菜小孢子離體培養(yǎng)條件

吳慧敏1，何勇1，邵泱峰2，朱祝軍1，符慶功1

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點實驗室，浙江臨安 311300；2.浙江省臨安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江臨安 311300）

以5個葉用芥菜Brassica juncea var.foliosa品種為試材，研究了游離小孢子培養(yǎng)過程中基因型、低溫預(yù)處理、高溫?zé)峒?、更新及加液和秋水仙堿等對小孢子胚狀體發(fā)生的影響。結(jié)果表明：有4個品種獲得胚狀體，各品種間胚狀體產(chǎn)量存在顯著差異，‘特選九心芥’胚產(chǎn)量最高；4℃低溫預(yù)處理24～48 h及33～34℃高溫?zé)峒ぬ幚?4～48 h對誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生和發(fā)育有促進作用；更新和添加培養(yǎng)基處理也可促進胚狀體發(fā)生，以質(zhì)量濃度為170.0 g·L-1的蔗糖起始培養(yǎng)48 h后添加等質(zhì)量濃度90.0 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基處理效果最佳；1～10 mg·L-1秋水仙堿24～48 h處理可提高小孢子培養(yǎng)反應(yīng)，增加供試材料胚產(chǎn)量。圖1表5參19

園藝學(xué)；葉用芥菜；小孢子培養(yǎng)；胚狀體；熱激；秋水仙堿

葉用芥菜Brassica juncea var.foliosa為十字花科Brassicaceae蕓薹屬Brassica1～2年生草本植物，其營養(yǎng)豐富，鮮食、加工均宜，深受廣大人民群眾喜愛，是中國栽培最為普遍的芥菜類蔬菜。目前，生產(chǎn)上葉用芥菜仍以常規(guī)品種為主[1]，傳統(tǒng)育種獲得純系及性狀穩(wěn)定后代需要多代自交和后代性狀選擇，所需年限較長[2]。利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得純合系，從而縮短雜交育種年限，提高選擇效力，加快優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)移是當(dāng)前葉用芥菜育種的重要技術(shù)方法和理想途徑，目前已在甘藍型油菜Brassica napus，白菜Brassica campestris ssp.chinensis，青花菜Brassica oleracea var.italica，甘藍Brassica oleracea等蕓薹屬蔬菜作物育種中得到廣泛應(yīng)用[3-7]。與蕓薹屬其他蔬菜相比，芥菜種Brassica juncea蔬菜游離小孢子培養(yǎng)建立困難，相關(guān)研究報道不多。目前，在葉用芥菜小孢子離體培養(yǎng)技術(shù)體系方面，也僅在金絲芥Brassica juncea var.multisecta，雪里Brassica juncea var.multiceps，結(jié)球芥Brassica juncea var.capitata、獨山大葉青Brassica juncea var.rugosa等部分品種上有少量研究報道[8-13]。小孢子誘導(dǎo)分化困難、成胚率低，仍然是當(dāng)前葉用芥菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系建立的主要問題。本試驗以5個不同葉用芥菜品種為材料，研究了不同遺傳背景、低溫預(yù)處理、高溫?zé)釗?、培養(yǎng)基更新及加液、秋水仙堿處理對小孢子胚狀體發(fā)生及發(fā)育的影響，以期為葉用芥菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)的有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以‘四季客家芥，‘上海金絲芥，‘溫州芥菜，‘特選九心芥，‘花葉香芥菜，等5個葉用芥菜品種為試驗材料。2010年和2011年秋季播種，塑料大棚內(nèi)越冬后于第2年春季3-4月花期進行小孢子培養(yǎng)。

1.2 花蕾的選擇和表面滅菌

臨近開花時，選取長度10 cm左右的主花序或頂部一級分枝花序于4℃保濕放置1～3 d，醋酸洋紅染色后鏡檢觀測小孢子發(fā)育時期，選取單核晚期小孢子所占比例較大的花蕾（直徑2～3mm），先用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡30 s，再用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞（HgCl2）處理10 min，無菌水沖洗5次。

1.3 小孢子分離及培養(yǎng)

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%的蔗糖B5液體培養(yǎng)基（含B5大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分，pH 5.8，高溫滅菌）為小孢子收集培養(yǎng)基；以不同蔗糖質(zhì)量濃度NLN培養(yǎng)基為小孢子培養(yǎng)液（含NLN大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分，蔗糖質(zhì)量濃度為90.0～170.0 g·L-1，pH 5.8，過濾滅菌）。表面滅菌后的花蕾放入無菌試管中·皿-1（加約3mL B5培養(yǎng)基），用無菌玻璃棒擠壓花蕾散出小孢子，經(jīng)38μm濾網(wǎng)過濾，收集濾液至10 mL離心管，600 r·min-1離心3 min，棄上清，加入B5培養(yǎng)基重新懸浮小孢子，離心重復(fù)3次。最后加入小孢子培養(yǎng)液，用血球計數(shù)器調(diào)整小孢子濃度為1×108個·L-1，分裝至60 mm×15 mm培養(yǎng)皿，3 mL·皿-1，Parafilm膜封口，33℃高溫?zé)峒ぬ幚?4 h后，轉(zhuǎn)入25℃靜置暗培養(yǎng)，待肉眼可見白色胚狀體后，轉(zhuǎn)至50 r·min-1的搖床震蕩培養(yǎng)。

接種30 d后統(tǒng)計胚狀體數(shù)量及子葉胚比例（將胚狀體分為子葉形胚和其他類型2種），用Duncan，s新復(fù)極差法進行顯著差異性分析。

1.4 小孢子發(fā)育細胞學(xué)與形態(tài)觀察

小孢子培養(yǎng)期間，用Nikon倒置顯微鏡（TS100-F）觀察小孢子細胞發(fā)育及形態(tài)變化，并拍照記錄。

1.5 胚狀體分化及植株再生

將子葉胚在光下培養(yǎng)轉(zhuǎn)綠后接種于B5+0.5mg·L-16-卞基氨基嘌呤（6-BA）+0.1mg·L-1萘乙酸（NAA）胚分化培養(yǎng)基上，萌發(fā)出芽后再轉(zhuǎn)入B5+0.2 mg·L-1NAA生根培養(yǎng)基上，生根形成完整植株；分化及生根培養(yǎng)基蔗糖質(zhì)量濃度均為30.0 g·L-1，瓊脂7.0 g·L-1，pH 5.8，高溫滅菌。

1.6 影響小孢子胚胎發(fā)生的單因素試驗

1.6.1 低溫預(yù)處理的影響供試材料花序保濕條件下，4℃低溫預(yù)處理24，48，72 h后分別進行小孢子游離培養(yǎng)，以不進行低溫預(yù)處理為對照。

1.6.2 高溫?zé)峒ぬ幚淼挠绊懝┰嚥牧戏蛛x出的游離小孢子在33，34，35℃靜置暗培養(yǎng)條件下分別進行24，48，72 h熱激處理，然后轉(zhuǎn)到25℃繼續(xù)培養(yǎng)，以25℃恒溫培養(yǎng)作對照。

1.6.3 更新及添加培養(yǎng)基的影響剛分離的小孢子在不同蔗糖質(zhì)量濃度NLN培養(yǎng)基中33℃熱激培養(yǎng)48 h后，經(jīng)過更換或添加等量培養(yǎng)基等不同處理后轉(zhuǎn)到25℃繼續(xù)培養(yǎng)，以NLN-13培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)為對照。其中NLN-9，NLN-13，NLN-17培養(yǎng)基均以NLN培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，蔗糖質(zhì)量濃度分別為90.0g·L-1，130.0 g·L-1和170.0 g·L-1。

1.6.4 秋水仙堿的影響將質(zhì)量濃度分別為1.0，10.0，50.0，100.0 mg·L-1的秋水仙堿添加至NLN-13小孢子培養(yǎng)基中，懸浮剛分離純化的小孢子培養(yǎng)24～48 h后，轉(zhuǎn)入不含秋水仙堿的NLN-13培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，以不含秋水仙堿培養(yǎng)基培養(yǎng)作對照。

以上各因素試驗每個處理培養(yǎng)30個花蕾的小孢子，重復(fù)3次，30 d后觀察胚狀體發(fā)生情況，統(tǒng)計胚狀體總數(shù)及子葉胚數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉用芥菜小孢子胚胎發(fā)生及植株再生

小孢子培養(yǎng)過程中，細胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，剛游離的小孢子（圖1-Ⅰ）經(jīng)高溫?zé)峒ぬ幚砗蟛糠中℃咦酉仁求w積膨大（圖1-Ⅱ），之后少數(shù)膨大小孢子發(fā)生1次細胞分裂（圖1-Ⅲ），后經(jīng)多次細胞分裂（圖1-Ⅳ），繼續(xù)發(fā)育形成球形胚，心型胚（圖1-Ⅴ）和魚雷型胚（圖1-Ⅵ）等，將光照條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)綠的子葉型胚（圖1-Ⅶ，1-Ⅷ）轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基進行胚萌發(fā)、分化、生根后獲得再生植株（圖1-Ⅸ）。

2.2 基因型對小孢子胚狀體誘導(dǎo)的影響

由表1可知：供試品種游離小孢子經(jīng)33℃高溫處理24 h，有‘上海金絲芥，‘特選九心芥，‘花葉香芥菜，3個品種產(chǎn)生胚狀體。不同基因型材料間胚狀體產(chǎn)量差異顯著，同時還發(fā)現(xiàn)產(chǎn)胚數(shù)量多的材料，子葉胚所占比例也相應(yīng)較高。‘特選九心芥，出胚總數(shù)最多，平均產(chǎn)胚2.20個·蕾-1，子葉胚比例也高達50.0%；‘花葉香芥菜，獲得胚狀體數(shù)量最少，平均產(chǎn)胚0.22個·蕾-1，子葉胚比例僅為34.7%；而‘四季客家芥，‘溫州芥菜，未能誘導(dǎo)出胚，經(jīng)33℃熱激培養(yǎng)4 h后，顯微鏡下觀察到上述兩品種有少量小孢子膨大現(xiàn)象，但之后未見有進一步的細胞分裂。

圖1 葉用芥菜小孢子離體培養(yǎng)過程中胚的發(fā)育及植株再生過程Figure 1 Developmentof embryos and plant regeneration duringmicrospores culture in Brassica juncea var.foliosa

表1 不同基因型葉用芥菜小孢子胚胎發(fā)生的差異Table 1 Differences ofmicrospore embryogenesis in different genotypes of Brassica juncea var.foliosa

2.3 低溫預(yù)處理對胚狀體誘導(dǎo)的影響

從表2可以看出：低溫處理24～48 h條件下供試材料產(chǎn)胚數(shù)量較高?！虾＝鸾z芥，最佳低溫預(yù)處理時間為48 h，平均出胚0.88個·蕾-1，為對照的1.5倍；‘特選九心芥，經(jīng)24～48 h低溫預(yù)處理胚狀體發(fā)生能力明顯提高，但隨著時間延長至72 h，出胚數(shù)由2.57個·蕾-1減少至1.59個·蕾-1，產(chǎn)胚能力明顯下降；與對照相比，‘花葉香芥菜，低溫預(yù)處理胚狀體數(shù)量差異不明顯。

表2 低溫預(yù)處理對葉用芥菜小孢子胚胎發(fā)生的影響Table 2 Effect of low temperature pretreatment onmicrospore embryogenesisof Brassica juncea var.foliosa

2.4 高溫?zé)峒ぬ幚韺ε郀铙w誘導(dǎo)的影響

由表3可知：不同熱激處理溫度和時間，供試材料小孢子產(chǎn)胚量差異顯著。33～34℃高溫?zé)峒ぬ幚砟茱@著提高大部分材料胚狀體發(fā)生頻率，35℃處理的胚狀體的發(fā)生數(shù)量則明顯減少。此外，高溫?zé)峒ぬ幚頃r間亦對小孢子產(chǎn)胚量有一定影響，33～34℃條件下處理24～48 h小孢子胚狀體誘導(dǎo)率較高；‘特選九心芥，在33℃熱激處理48 h條件下出胚量最高，平均產(chǎn)胚2.71個·蕾-1，隨著熱激處理時間延長至72 h，產(chǎn)胚量明顯下降；‘上海金絲芥，則以34℃處理24 h最佳，‘花葉香芥菜，以34℃處理48 h效果最佳。對照處理5個基因型材料則均未誘導(dǎo)出胚狀體。

表3 高溫處理對葉用芥菜小孢子胚胎發(fā)生的影響Table 3 Effect of high temperature onmicrospore embryogenesis of Brassica juncea var.foliosa

2.5 更新及添加培養(yǎng)基對胚狀體誘導(dǎo)的影響

從表4可以看出：在6個處理中，質(zhì)量濃度為17%的蔗糖起始培養(yǎng)后添加等量的90.0 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)效果最好。該處理能顯著提高‘上海金絲芥，‘特選九心芥，‘花葉香芥菜，胚狀體發(fā)生頻率；170.0 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，重新離心更換130.0 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基亦能顯著提高‘上海金絲芥，‘花葉香芥菜，產(chǎn)胚能力；而170.0 g·L-1蔗糖持續(xù)培養(yǎng)則嚴(yán)重抑制小孢子胚狀體發(fā)育，所有供試材料均無法獲得胚狀體。130.0 g·L-1蔗糖起始培養(yǎng)后更新或加液等處理對小孢子胚狀體誘導(dǎo)的影響則因材料不同而效果不盡相同。

表4 更新及加液對葉用芥菜小孢子胚胎發(fā)生的影響Table 4 Effect ofadding and replacingmedium onmicrospore embryogenesis of Brassica juncea var.foliosa

2.6 秋水仙堿對胚狀體誘導(dǎo)的影響

由表5結(jié)果可以看出：適宜的秋水仙堿質(zhì)量濃度及其時間處理能夠有效促進小孢子胚胎發(fā)生。試驗中，1.0～10.0 mg·L-1低質(zhì)量濃度秋水仙堿處理能顯著提高大部分材料產(chǎn)胚量，隨著質(zhì)量濃度提高，100.0 mg·L-1秋水仙堿處理則明顯抑制胚狀體的產(chǎn)生。1.0 mg·L-1秋水仙堿處理24～48 h，能顯著提高‘特選九心芥，出胚量，最高達3.16個·蕾-1；10.0mg·L-1秋水仙堿處理24～48 h，則顯著提高‘花葉香芥菜，胚產(chǎn)量；10.0 mg·L-1秋水仙堿處理48 h比24 h不僅顯著增加胚產(chǎn)量，子葉胚比例亦提高5.7%?！虾＝鸾z芥，最佳處理條件為50.0mg·L-1處理24 h，出胚量最高達1.68個·蕾-1，處理時間延長為48 h，出胚量則迅速降低僅為0.99個·蕾-1。可見較低質(zhì)量濃度秋水仙堿及適宜時間組合有助于促進胚狀體產(chǎn)生，高質(zhì)量濃度秋水仙堿及長時間處理則會造成毒害。

表5 秋水仙堿處理對葉用芥菜小孢子胚胎發(fā)生的影響Table 5 Effect of colchicine treatmenton microspore embryogenesis of Brassica juncea var.foliosa

3 討論

材料的遺傳背景對小孢子胚狀體發(fā)生有較大影響，相同條件下，不同基因型材料小孢子培養(yǎng)效果存在顯著差異。劉冬等[8]利用7種基因型芥菜進行小孢子培養(yǎng)試驗，6種基因型獲得了小孢子胚，3種基因型得到了再生植株；本試驗以5個葉用芥菜品種為材料，最終有4個基因型材料成功誘導(dǎo)胚狀體，胚產(chǎn)量最高為3.16個·蕾-1，而有的材料未能出胚或產(chǎn)量較低，供試基因型之間小孢子胚狀體發(fā)生能力差異很大，這與前人結(jié)論一致。

適宜的溫度和時間處理可以改善小孢子代謝，利于小孢子適應(yīng)離體后培養(yǎng)環(huán)境，促進其正常生長。王亦菲等[14]研究表明：4℃低溫預(yù)處理油菜1～2 d有利于提高胚胎發(fā)生。但耿建峰等[7]報道接種前低溫預(yù)處理花蕾對白菜小孢子胚誘導(dǎo)率影響差異不大，超過5 d反而下降。本試驗中不同基因型葉用芥菜對低溫預(yù)處理反應(yīng)不同，有些品種低溫預(yù)處理24～48 h能顯著提高胚狀體的產(chǎn)量，有些則與對照無明顯差異，因而，實踐應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)具體材料做相應(yīng)探索與研究。

高溫?zé)峒τ趩有℃咦臃至押透淖冃℃咦佣ㄏ虬l(fā)育具有重要作用，廣泛應(yīng)用于蕓薹屬作物花藥培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)。劉冬等[8]報道對芥菜小孢子采用25，30，33，35℃熱激處理3 d，只有33℃處理出胚。本試驗表明33～34℃高溫?zé)峒ぬ幚砣~用芥菜小孢子24～48 h對胚狀體誘導(dǎo)效果較好，72 h培養(yǎng)明顯降低胚狀體的發(fā)生頻率。

蔗糖是小孢子培養(yǎng)過程中主要碳源和滲透壓調(diào)節(jié)劑，糖質(zhì)量濃度對維持小孢子活力及胚狀體的發(fā)生有重要影響。采用更新或加液培養(yǎng)能顯著提高胚產(chǎn)量，在蕓薹屬其他作物游離小孢子培養(yǎng)中已有報道[15-17]。本試驗采用質(zhì)量濃度為170.0 g·L-1的蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后添加等量的90.0 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基，使終質(zhì)量濃度為130.0 g·L-1，顯著提高了葉用芥菜小孢子產(chǎn)胚數(shù)量。試驗中，添加培養(yǎng)基處理胚狀體誘導(dǎo)率顯著好于培養(yǎng)基更新處理，可能與低質(zhì)量濃度蔗糖培養(yǎng)基等量添加既可以補充營養(yǎng)物質(zhì)、降低培養(yǎng)液中不利代謝產(chǎn)物濃度，又可以避免培養(yǎng)基更新時重新離心對小孢子造成的傷害有關(guān)。

秋水仙堿直接處理游離小孢子提高出胚率及成苗率，在油菜等小孢子培養(yǎng)中有較多應(yīng)用[17-19]，但秋水仙堿對葉用芥菜的影響，目前，還未見報道。本試驗結(jié)果表明：較低質(zhì)量濃度秋水仙堿處理可以顯著提高4個品種胚狀體產(chǎn)量；對于難出胚品種‘溫州芥菜，，適宜質(zhì)量濃度的秋水仙堿處理后明顯促進胚狀體發(fā)生。

本試驗在比較遺傳背景、低溫預(yù)處理、高溫?zé)釗舻纫蛩貙θ~用芥菜小孢子胚狀體發(fā)生影響的基礎(chǔ)上，進一步研究了培養(yǎng)液更新及添加、秋水仙堿處理條件下葉用芥菜小孢子胚狀體出胚及發(fā)育的影響，初步建立了部分葉用芥菜品種的游離小孢子培養(yǎng)體系。但由于影響小孢子胚狀體誘導(dǎo)分化的因素極為復(fù)雜，目前，葉用芥菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系相關(guān)探索與研究也比較少，相比蕓薹屬其他種蔬菜，現(xiàn)有研究小孢子胚狀體誘導(dǎo)率仍然偏低。因此，育種實踐中，結(jié)合不同育種材料，進一步深入研究、完善葉用芥菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)，建立穩(wěn)定、高效的小孢子再生植株獲得體系，才能有效加強小孢子培養(yǎng)技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)的結(jié)合，提高葉用芥菜的育種效率。

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In vitromicrospore culture of leafmustard

WU Huimin1，HE Yong1，SHAO Yangfeng2，ZHU Zhujun1，F(xiàn)U Qinggong1
（1.The Key of Laboratory for Quality Improvement of Agricultural Products of Zhejiang Province，Zhejiang A&F University，Lin，an 311300，Zhejiang，China；2.Agricultural Technology Promotion Center of Lin，an City，Lin，an 311300，Zhejiang，China）

In order to improve the isolated microspore culture system inBrassica juncea var.foliosa，five differentgenotypes ofBrassica juncea var.foliosawere used to investigate the contribution of genotype，cool-pretreatment，heat shock，medium replacement and addition，as well as concentration of colchicine on microspore embryogenesis in vitro.Results showed that embryoids were obtained from four genotypes，and significant differences（P＜0.05，Duncan，s MRT）were observed for embryo yield with the highest yield being‘Texuan-jiuxin，.For all cultivars，24-48 h of cool-pretreatment at 4℃and heat shock at 33-34℃improved embryo yields.Also，medium addition and replacement enhanced microspore embryogenesis with the best treatment using a constant volume for a 90.0 g·L-1sucrose medium supplemented to a 170.0 g·L-1sucrose concentration medium after 48 h.In addition，treating the freshly isolated microspore with 1-10 mg·L-1colchicine for 24-48 h greatly improved（P＜0.05，Duncan，s MRT）embryo yields of the four cultivars.The present results could be used to obtain haploid efficiently for the plant breeding and basic research inBrassica juncea var.foliosa.[Ch，1 fig.5 tab.19 ref.]

horticulture；leafmustard；microspore culture；embryoid；heat shock；colchicine

S637.2

A

2095-0756（2014）02-0315-07

2013-03-21；

2013-06-18

浙江省教育廳資助項目（2273000001）

吳慧敏，實驗師，從事園藝作物遺傳育種研究。E-mail：hminw@163.com。通信作者：符慶功，講師，從事蔬菜種質(zhì)資源與遺傳育種方向研究。E-mail：fuqinggong@163.com