一例高致病性藍(lán)耳病病毒、圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌混合感染的診斷

蔣建國1 張顯浩2 劉好朋2 賀東生3*

（1廣西桂林市蔬菜研究所，廣西桂林 541004；2廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司，廣東新興 527400；3華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

一例高致病性藍(lán)耳病病毒、圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌混合感染的診斷

蔣建國1 張顯浩2 劉好朋2 賀東生3*

（1廣西桂林市蔬菜研究所，廣西桂林 541004；2廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司，廣東新興 527400；3華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

目前，豬場疫病混合感染的現(xiàn)象普遍存在，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。2013年10月，廣西省某集約化豬場約6周齡豬群發(fā)生以高熱、皮膚發(fā)紺、呼吸困難、關(guān)節(jié)炎為主要特征的傳染病。根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢變化并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行綜合診斷，最終結(jié)果顯示，導(dǎo)致該豬場大規(guī)模發(fā)病并死亡的主要病原包括高致病性豬藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌，是典型的混合感染導(dǎo)致大規(guī)模發(fā)病及死亡的案例。

高致病性豬藍(lán)耳病病毒；豬圓環(huán)病毒2型；副豬嗜血桿菌；混合感染

高致病性豬藍(lán)耳?。╤pPRRS）是由基因缺失變異的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的豬的新型傳染病，可造成母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸癥狀，具有發(fā)病快、死亡率高等特點(diǎn)[1,2]。豬圓環(huán)病毒病是由豬2型圓環(huán)病毒（PCV2）感染導(dǎo)致的豬的一種免疫抑制性疾病，主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征[3]、保育豬和育肥豬的呼吸道疾病[4]及肉芽腫性腸炎[5]，并可使懷孕母豬發(fā)生繁殖障礙[6]。副豬嗜血桿菌（Hps）是豬上呼吸道的一種常在菌，在豬體免疫力降低時(shí)，可能轉(zhuǎn)化為致病菌，引起以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、高熱和高死亡率為特征的全身性疾病[7]。由于病原種類的日趨復(fù)雜及飼養(yǎng)管理不當(dāng)，豬場疫病混合感染的情況普遍存在。hpPRRS和PCV2均是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重大疾病，hpPRRS可引發(fā)豬體高熱、母豬繁殖障礙和仔豬的嚴(yán)重呼吸癥狀，死亡率很高，并能使豬體免疫受到抑制；單獨(dú)的PCV2感染雖不致病，但亦可引發(fā)豬體免疫抑制；而Hps多發(fā)于豬體免疫力降低時(shí)，但這種并發(fā)或繼發(fā)感染卻使豬群臨床癥狀更加復(fù)雜，同時(shí)使死亡率大大提高。本研究以2013年10月廣西某規(guī)?；i場約6周齡的豬群出現(xiàn)高熱、皮膚發(fā)紺、呼吸困難、關(guān)節(jié)炎等癥狀為案例，進(jìn)行臨床及實(shí)驗(yàn)室綜合診斷。

1 臨床癥狀及剖檢病變

2013年10月，廣西省某集約化豬場6周齡左右的保育仔豬突然發(fā)病，短時(shí)間內(nèi)發(fā)病豬只迅速擴(kuò)增至200頭，發(fā)病率高達(dá)60%，并呈現(xiàn)繼續(xù)傳染態(tài)勢。發(fā)病初期，以高熱、咳嗽、皮紅、耳朵發(fā)紺、腹股溝淋巴結(jié)腫脹為主，幾天后仔豬出現(xiàn)呼吸困難，關(guān)節(jié)腫脹、跛行，皮下水腫。發(fā)病豬多數(shù)出現(xiàn)全身淋巴結(jié)腫大出血，胸腔纖維素性滲出，心包積液，個(gè)別剖檢病死豬有胸膜粘連現(xiàn)象；肺臟表面有纖維素性滲出物，肺部出血，間質(zhì)性肺炎，個(gè)別肺心葉肉變；個(gè)別腹部腸系膜表面有纖維素性滲出；腎、脾臟腫大，表面有纖維素性滲出物；關(guān)節(jié)液增多，且質(zhì)地黏稠。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 材料及方法

細(xì)菌培養(yǎng)基購自廣州環(huán)凱公司產(chǎn)品；病毒DNA/RNA抽提試劑盒、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、RT-PCR一步法試劑盒和ExTaq DNA聚合酶購自TAKARA公司；高致病性豬藍(lán)耳病檢測試劑盒購自北京世紀(jì)元亨公司，所用各種引物均為本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合成。

2.2 細(xì)菌檢測

無菌采集病豬心包液，并將心包液、關(guān)節(jié)液、肺臟接種于鮮血培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基（MAC）、胰蛋白大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基上，37℃溫箱中培養(yǎng)24～48小時(shí)。挑取單菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色和瑞氏染色鏡檢。挑取單菌落接種至液體培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，利用細(xì)菌DNA抽提試劑盒提取分離培養(yǎng)物的總DNA，應(yīng)用PCR方法檢測副豬嗜血桿菌。

2.3 病毒核酸檢測

選取具有典型病變特征的肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體、脾臟等臟器進(jìn)行研磨處理后，利用TAKARA MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒進(jìn)行病毒DNA和RNA的抽提，采用PCR和RT-PCR方法對(duì)PCV2、hpPRRSV、PRSV、CSFV進(jìn)行檢測。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌檢測結(jié)果

經(jīng)接種培養(yǎng)，在TSA培養(yǎng)基上長出一些小而透明的菌落，其余培養(yǎng)基無菌落生長。染色鏡檢顯示，生長菌為革蘭氏陰性的小桿菌，瑞氏染色兩極濃染。細(xì)菌分離純化后，抽提DNA進(jìn)行副豬嗜血桿菌PCR檢測，結(jié)果顯示，被檢樣品在相應(yīng)位置出現(xiàn)620 bp的陽性擴(kuò)增條帶（圖1a），與預(yù)期片段大小相符，說明分離細(xì)菌為副豬嗜血桿菌。

3.2 病毒核酸檢測結(jié)果

分別以提取的病毒DNA或RNA及PCV2、PRV、hpPRRSV、CSFV特異性檢測引物或試劑盒進(jìn)行PCR或RT-PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示：PCV2引物的PCR擴(kuò)增出773 bp的陽性條帶，hpPRRSV試劑盒的RT-PCR擴(kuò)增出272 bp的陽性條帶，均與預(yù)期片段大小相符；而PRV、CSFV檢測無陽性條帶出現(xiàn)，為陰性（圖1）。

圖1 PCR/RT-PCR的實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果

4 討論

分子生物學(xué)診斷技術(shù)的應(yīng)用為疫病的快速確診提供了捷徑，尤其是PCR方法的應(yīng)用，已經(jīng)成為現(xiàn)今最簡單、最便捷的分子生物學(xué)診斷方法。本次疫情就是在結(jié)合發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢病變的基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室PCR診斷結(jié)果，確診本次廣西省某集約化豬場發(fā)生的疫情為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌的混合感染。

近年來，由于多種原因，集約化豬場各種混合感染的疫情屢見不鮮，且多以各種形式存在，以PRRSV、PCV2、PRV、CSFV混合感染為主，給臨床病原學(xué)的確診和防治增加了一定難度，并影響了我國現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的健康快速發(fā)展。尤其2006年高致病性豬藍(lán)耳病暴發(fā)以來，該病給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失，由此引起的豬群免疫力低下、免疫抑制，極易造成豬群的混合感染和繼發(fā)感染。

目前，對(duì)混合感染疫病只能通過合理的免疫程序、采取一定的綜合防治措施、強(qiáng)化衛(wèi)生消毒、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、嚴(yán)格控制引種和“全進(jìn)全出”來防控；同時(shí)定期進(jìn)行免疫抗體水平監(jiān)測，提高免疫效果和豬群對(duì)疫病的抵抗力。

[1]陳瑞愛,裴仉福,羅滿林.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的免疫效果觀察[J].中國動(dòng)物保健,2009(7):83-86.

[2]劉永宏,趙麗,劉俊峰,等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒BJBLZ株序列剖析[J].生物技術(shù)通訊,2011(10):185-190.

[3]朗洪武,程君生,張廣川.豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征[J].中國獸醫(yī)雜志,2000(1):39-42.

[4]Cheng CC,Lee YF,Lin NN,et al.Bronchiolitis obliterans organizing pneumonia in swine associated with porcine circovirus type2infection[J].JBiomedBiotechnol2011.doi: 10.1155/2011/245728.

[5]Kim J,Ha Y,Jung K,et al.Enteritis associated with porcine circovirus 2 in pigs[J].Can J Vet Res,2004(68):218-221.

[6]Chae C.A review of porcine circovirus 2-associated syndromes and diseases[J].Vet J.2005,169(3):326-336.

[7]趙德明,張仲秋,沈建忠,譯.豬病學(xué)[M].第九版.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2009:769-782.

S858.28

B

1673-4645(2014)10-0051-03

2014-05-19

廣東省農(nóng)業(yè)科技重大技術(shù)研究項(xiàng)目(粵財(cái)農(nóng)[2013]185號(hào))

*通訊作者:賀東生，博士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)傳染病