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    凝膠注入系統(tǒng)在DNA分型中的影響分析及解決方法

    2014-04-24 01:43:44常海龍公安部第一研究所
    警察技術(shù) 2014年6期
    關(guān)鍵詞:針閥毛細(xì)管電泳

    常海龍 公安部第一研究所

    一、引言

    DNA分型自20世紀(jì)80年代中期問世以來,在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引發(fā)了革命性的變革,極大提高了執(zhí)法部門根據(jù)現(xiàn)場搜尋罪犯的能力。DNA分型就是通過對遺傳物質(zhì)DNA序列多態(tài)性及長度多態(tài)性的檢驗來進(jìn)行法醫(yī)學(xué)的個體識別及親權(quán)鑒定。如今,該技術(shù)已經(jīng)成為法醫(yī)物證檢驗的常規(guī)技術(shù),為打擊違法犯罪提供了強有力的武器。

    毛細(xì)管凝膠電泳是目前應(yīng)用最為廣泛、技術(shù)最為成熟的主流DNA分型技術(shù),被全世界范圍內(nèi)的法醫(yī)學(xué)DNA實驗室廣泛采用。毛細(xì)管凝膠電泳向毛細(xì)管柱中充入凝膠聚合物等篩分介質(zhì),通過建立高壓直流電場驅(qū)動帶負(fù)電的DNA片段,通過篩分介質(zhì),對DNA片段按其大小進(jìn)行篩分分離。

    公安部第一研究所在國家十一五課題“法醫(yī)DNA專用檢測硬件平臺關(guān)鍵技術(shù)研究”的支撐下,成功研制了基于毛細(xì)管凝膠電泳的GA118-16A遺傳分析儀,其中凝膠注入系統(tǒng)是具有自主知識產(chǎn)權(quán)的關(guān)鍵核心部件。本文對凝膠注入系統(tǒng)工作原理及對DNA分型結(jié)果影響要素進(jìn)行分析,結(jié)合在凝膠注入系統(tǒng)研制過程及產(chǎn)業(yè)化過程中遇到的常見問題,提出解決方法,期待對公安系統(tǒng)廣大法醫(yī)工作者有所幫助,以更好應(yīng)用遺傳分析儀,為打擊違法犯罪提供更加高效的手段。

    二、DNA分型原理及常用篩分介質(zhì)

    理想的DNA分離介質(zhì)應(yīng)具備以下幾種性質(zhì):(1)高親水性,(2)良好的溶解能力,(3)良好的篩分性能,(4)在堿性條件下仍具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性,(5)具有動態(tài)涂層能力以抑制電滲流及消除DNA和毛細(xì)管管壁的吸附作用。

    毛細(xì)管凝膠電泳最常采用聚二甲基丙烯酰胺POP-4和POP-7聚合物用于DNA分型。聚二甲基丙烯酰胺有一定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),是由聚丙烯酰胺和交聯(lián)共聚單體N,N’-甲叉雙丙烯酰胺在TEMED催化下聚合交聯(lián)形成的,其孔徑與鏈長度和交聯(lián)度有關(guān)。

    聚二甲基丙烯酰胺的優(yōu)點是吸附很小,能夠有效消除毛細(xì)管電滲現(xiàn)象;減小分子擴(kuò)散,抗對流;具有分子篩效應(yīng),遷移時間能反映組分分子量大??;在一定溫度范圍內(nèi)透明,便于觀察和實現(xiàn)樣品的光學(xué)檢測。但其制備復(fù)雜、產(chǎn)生氣泡會中斷電路,一些大分子積留會影響毛細(xì)管柱的壽命,影響聚合物的動態(tài)涂層能力和降低聚合物的黏度。

    三、凝膠注入系統(tǒng)的組成及工作原理

    要實現(xiàn)毛細(xì)管電泳的DNA分型,首先必須將聚二甲基丙烯酰胺等篩分介質(zhì)注入內(nèi)徑僅為50μm的毛細(xì)管,這需要系統(tǒng)提供很高的壓強,凝膠注入系統(tǒng)正是為實現(xiàn)這一功能而設(shè)計的。該系統(tǒng)由精密分配泵、針閥系統(tǒng)、下膠塊、凝膠瓶、高壓電極、毛細(xì)管等組成,系統(tǒng)工作介質(zhì)為聚二甲基丙烯酰胺凝膠。精密分配泵提供動力源,將凝膠瓶中的凝膠吸入泵倉。凝膠瓶管路末端接上單向閥,當(dāng)精密分配泵的柱塞向下運動時,單向閥關(guān)閉。若此時針閥系統(tǒng)打開,即下膠塊管路開通,由于毛細(xì)管的流體阻力遠(yuǎn)大于下膠塊管路,凝膠將向下膠塊管路流動,在排除氣泡過程中經(jīng)常應(yīng)用此操作。當(dāng)針閥系統(tǒng)關(guān)閉時,即下膠塊管路閉合,凝膠將向毛細(xì)管中運動,向毛細(xì)管中注入凝膠,從而實現(xiàn)毛細(xì)管的自動注膠功能。該系統(tǒng)組成參見圖2。

    該系統(tǒng)具有氣泡排除功能。由于凝膠自身混有一定的氣泡,同時在更換凝膠的過程中,不可避免的會帶入氣泡。氣泡的存在將阻斷電泳通路或使通路不穩(wěn)定。因此,當(dāng)凝膠注入系統(tǒng)中有氣泡時,必須運行該系統(tǒng)的排氣泡操作,確保注入毛細(xì)管中的凝膠沒有氣泡。

    為實現(xiàn)凝膠注入和排除氣泡操作,凝膠注入系統(tǒng)在下膠塊位置設(shè)計了針閥系統(tǒng),這個子系統(tǒng)由電磁鐵、針閥銷、針閥構(gòu)成,其組成見圖3。當(dāng)需要閉合針閥系統(tǒng)時,電磁鐵關(guān)閉,電磁鐵帶動針閥銷轉(zhuǎn)動,使針閥向下運動,與下膠塊的錐形孔形成緊密配合。為了緩沖電磁鐵閉合時針閥對下膠塊的沖擊,在電磁鐵與針閥銷之間設(shè)置了一個彈簧及調(diào)節(jié)螺釘,當(dāng)電磁鐵閉合時,彈簧起到一定的緩沖作用,并為針閥與下膠塊的閉合提供密封壓強。

    四、DNA分型中凝膠注入系統(tǒng)的影響分析及解決方法

    作為基于毛細(xì)管電泳的DNA檢測儀的重要組成部分,凝膠注入系統(tǒng)的工作狀態(tài)直接影響到DNA的檢測結(jié)果。以下是DNA檢測過程中遇到的相關(guān)問題及解決方法:

    為進(jìn)一步確保城區(qū)河道的行洪安全、維護(hù)河道生態(tài)健康、美化水城環(huán)境,臨沂市在沂河干支流上科學(xué)規(guī)劃建設(shè)了一系列橡膠壩和攔河閘,并通過建設(shè)開通河道間調(diào)水工程,構(gòu)建城市水網(wǎng),實現(xiàn)城區(qū)河道間生態(tài)用水的優(yōu)化配置,促進(jìn)水網(wǎng)內(nèi)的水循環(huán),實現(xiàn)了臨沂城區(qū)的水資源優(yōu)化配置、防洪安全和水系生態(tài)安全。

    (一)凝膠注入系統(tǒng)氣泡排除問題及解決方法

    凝膠注入系統(tǒng)一個重要的功能就是將電泳通道中凝膠的氣泡排除。氣泡會阻斷電泳通路或改變電泳遷移率,導(dǎo)致嚴(yán)重的區(qū)帶擴(kuò)展,降低分辨力,影響DNA檢測結(jié)果。如果氣泡進(jìn)入毛細(xì)管中,直流高壓電場被切斷,電泳無法形成,不能通過篩分作用對DNA片段進(jìn)行分離;如果氣泡進(jìn)入集束端安裝位置或下膠塊管路中,會導(dǎo)致電泳通道變窄,電阻變大,電泳通道發(fā)熱,這將導(dǎo)致膠的黏度等性質(zhì)發(fā)生變化,從而改變DNA片段在電泳過程中的遷移率,影響分離效果,嚴(yán)重時會損壞集束端和下膠塊管路。

    氣泡常出現(xiàn)的位置有三種情況:

    1.凝膠瓶管路出現(xiàn)氣泡

    在更換凝膠瓶的過程中可能會引入新的氣泡,氣泡位于凝膠瓶管路中,此時應(yīng)運行自動排氣泡程序排出氣泡。因此,在更換凝膠瓶之前,應(yīng)該將待用凝膠常溫靜置2小時以上,以使凝膠中的氣泡析出;同時在更換凝膠瓶的過程中避免劇烈操作,防止凝膠瓶管路中混入氣泡。

    2.毛細(xì)管集束端出現(xiàn)氣泡

    當(dāng)毛細(xì)管集束端位置紡錘體密封不嚴(yán)時,在集束端容易出現(xiàn)氣泡。毛細(xì)管集束端出現(xiàn)氣泡會導(dǎo)致高壓電泳通道電阻增大,氣泡位置發(fā)熱,從而影響DNA片段的遷移率,同時容易損壞集束端。此時應(yīng)該擰松手輪,運行精密分配泵,使精密分配泵柱塞向下運動,使氣泡隨凝膠從集束端排除。由于凝膠具有生物毒性,操作中應(yīng)佩戴手套操作,并使用滴水盤收集排除的凝膠。

    3.下膠塊管路出現(xiàn)氣泡

    當(dāng)陽極杯中的緩沖液沒有達(dá)到指定體積(即達(dá)到刻度線)時,由于下膠塊管路處于開放狀態(tài),在溫度變化的時候氣泡容易進(jìn)入下膠塊管路。此處氣泡會導(dǎo)致下膠塊管路局部發(fā)熱,從而影響DNA片段的遷移率,同時容易損壞下膠塊管路。此時應(yīng)該運行精密分配泵,使精密分配泵柱塞向下運動,使氣泡隨凝膠從下膠塊排除。

    (二)凝膠注入系統(tǒng)凝膠無法注入問題及解決方法

    凝膠注入系統(tǒng)的主要功能是向毛細(xì)管中注入凝膠,在遺傳分析儀的使用過程中,由于各種因素的影響,會使凝膠注入系統(tǒng)無法正常工作。如果儀器繼續(xù)運行,毛細(xì)管內(nèi)殘留的廢膠會導(dǎo)致毛細(xì)管電泳過程中出現(xiàn)雜峰;同時會使DNA片段的遷移率變低,峰值變寬,DNA檢測過程無法正常完成。相關(guān)的問題原因及解決辦法如下:

    1.如果凝膠瓶管路出現(xiàn)凝膠回流現(xiàn)象,則是單向閥出現(xiàn)故障

    在發(fā)現(xiàn)凝膠注入系統(tǒng)出現(xiàn)無法注入凝膠的情況,首先應(yīng)該檢查凝膠瓶管路是否出現(xiàn)凝膠回流現(xiàn)象,如果出現(xiàn),說明單向閥無法實現(xiàn)單向密封作用。單向閥內(nèi)部是由一個紅寶石球和藍(lán)寶石座組成的精密單向密封裝置,在長期不使用凝膠注入系統(tǒng)的時候,紅寶石球和藍(lán)寶石座由于凝膠干結(jié)附著在密封件表面,從而使單向閥失去單向密封能力。此時應(yīng)取下單向閥,用超純水潤洗單向閥,清洗完畢后,再重新吸入凝膠,完成凝膠注入工作。

    2.如果水洗密封艙出現(xiàn)凝膠,說明高壓密封圈損壞

    精密分配泵的高壓實現(xiàn)是由藍(lán)寶石柱塞和高壓密封圈配合實現(xiàn),由于長時間工作,或者由于凝膠注入系統(tǒng)長期不工作導(dǎo)致凝膠干結(jié)在柱塞表面,在柱塞運動過程中可能會損壞高壓密封圈,使藍(lán)寶石柱塞與高壓密封圈之間出現(xiàn)泄漏,凝膠將從此位置泄漏到水洗密封艙內(nèi)。此時,應(yīng)該立即停止精密分配泵的操作,更換高壓密封圈。

    3.如果下膠塊管路接頭處出現(xiàn)凝膠,說明下膠塊管路接頭密封不嚴(yán)

    下膠塊管路接頭是凝膠注入系統(tǒng)實現(xiàn)高壓的一個關(guān)鍵部件,采用錐形密封頭配合精密分配泵及下膠塊實現(xiàn)密封,如果固定螺母沒足夠預(yù)壓力,就會出現(xiàn)凝膠泄漏現(xiàn)象。此時應(yīng)加大密封接頭固定螺母的擰緊力度,使其達(dá)到密封效果。

    4.如果在毛細(xì)管集束端出現(xiàn)凝膠泄漏,說明毛細(xì)管集束端密封不嚴(yán)

    毛細(xì)管集束端是與錐形紡錘體與手輪的配合實現(xiàn)密封,手輪依靠螺紋實現(xiàn)預(yù)緊力,紡錘體的兩端錐形面與精密分配泵和手輪密封面的配合實現(xiàn)高壓密封。此時,首先應(yīng)擰緊手輪,加大手輪的預(yù)緊力,以提高密封面的壓力;如果加大預(yù)緊力后仍然出現(xiàn)凝膠泄漏現(xiàn)象,則是紡錘體表面有殘留雜質(zhì),應(yīng)取出紡錘體及手輪,超純水潤洗后,重新安裝毛細(xì)管集束端。

    5.如果從陽極杯觀察到下膠塊有凝膠流出,說明下膠塊針閥密封不嚴(yán)

    下膠塊針閥密封是依靠針閥的錐形面與下膠塊配合實現(xiàn)高壓密封,常見的泄漏情況有兩種:(1)由于磨損導(dǎo)致針閥壓力不夠。針閥和下膠塊均采用塑料制成,在長期開合過程中難免有一定的磨損,此時針閥與下膠塊的配合間隙加大,容易出現(xiàn)凝膠泄漏現(xiàn)象。遇到這種情況,應(yīng)該調(diào)節(jié)電磁鐵調(diào)節(jié)螺釘,增加電磁鐵與針閥銷之間彈簧的彈力,從而加大針閥與下膠塊配合的壓力,實現(xiàn)高壓密封。(2)下膠塊或針閥損壞。在磨損進(jìn)一步加大的情況下,由于下膠塊或者針閥磨損不規(guī)則性導(dǎo)致密封面無法緊密配合,此時加大彈簧彈力也無法實現(xiàn)高壓密封,應(yīng)更換下膠塊或者針閥。

    6.大分子堵塞毛細(xì)管導(dǎo)致凝膠注入壓力過大

    在毛細(xì)管長期使用過程中,一些大分子會殘留在毛細(xì)管內(nèi)壁,隨著時間的推移,積累越來越多,最終導(dǎo)致精密分配泵的壓力不足以將適量的凝膠注入到毛細(xì)管中。這種情況需要更換新的毛細(xì)管,再進(jìn)行凝膠注入。

    五、結(jié)論

    凝膠注入系統(tǒng)是遺傳分析儀的重要組成部分,凝膠注入的性能對DNA分型結(jié)果產(chǎn)生顯著影響,關(guān)系到設(shè)備整體工作成本、效率和使用壽命。要使凝膠注入系統(tǒng)盡可能長時間地保持安全、高效的工作狀態(tài),就一定要保證凝膠注入的質(zhì)量,科學(xué)合理地解決在使用中遇到的問題。

    本文結(jié)合在凝膠注入系統(tǒng)研制和產(chǎn)業(yè)化過程中遇到的問題,對凝膠注入系統(tǒng)的工作原理進(jìn)行分析,提出了法醫(yī)DNA工作人員常見問題出現(xiàn)的原因及解決方法。經(jīng)過大量實踐驗證,上述方法能夠有效解決凝膠注入系統(tǒng)工作中遇到的問題,保證遺傳分析儀高效穩(wěn)定地工作。

    [1]John M.Butler.侯一平,李成濤譯.法醫(yī)DNA分型專論: 方法學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2013:122-123.

    [2]陳義.毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用(第二版)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006:59-60.

    [3]方梅,胡波,田貴容,徐恒,方國楨.21世紀(jì)毛細(xì)管電泳在刑偵分析中的應(yīng)用[J].分析儀器,2011(1):1-3.

    [4]龐曉東,陳學(xué)亮等.DNA檢測儀器及其發(fā)展動向分析[J].警察技術(shù),2014,1(142):8-11.

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