高效液相法同時測定葡萄酒中3種防腐劑和2種甜味劑

杭 莉

（泰州市疾病預(yù)防控制中心,江蘇 泰州 225300）

食品添加劑是為改善食品品質(zhì)和色、香、味，以及為防腐、保鮮和加工工藝的需要而加入食品中的人工合成或者天然物質(zhì)[1]。目前在食品工業(yè)中發(fā)揮越來越重要的作用。也許正由于這種可觀利潤的誘惑，食品添加劑濫用的現(xiàn)象越來越嚴重。在目前所使用的添加劑中，絕大多數(shù)為人工化學合成添加劑，過量的食用此類人工合成添加劑可以引發(fā)人體急性或慢性中毒，從而嚴重危害人們的健康。葡萄酒以新鮮葡萄或葡萄汁為原料，經(jīng)部分或完全發(fā)酵而成，在適量飲用的條件下，能夠防治各種疾病，增強人體健康，是被公認的對人體有益的健康酒精飲品[2]。國標GB15037—2006《葡萄酒》規(guī)定葡萄酒中不得添加合成著色劑、甜味素、香精、增稠劑。因此，建立一種快速測定葡萄酒中的各種添加劑的方法，對于食品行業(yè)的衛(wèi)生監(jiān)管具有重要意義。

目前，添加劑的測定方法主要有國家標準[3-7]和高效液相色譜的方法[8-15]。國標需要使用不同的儀器進行測定，而且只能單一的檢測1種或2～3種添加劑，對待同一種樣品還需要經(jīng)過不同的前處理的方法，耗時耗力，還增加了成本。而對于同時測定葡萄酒中這5種添加劑的高效液相色譜方法在國內(nèi)報道的也不多。采用高效液相的方法，前處理簡單，操作便捷，能夠在20 min內(nèi)同時測定出葡萄酒中的3種防腐劑和2種甜味劑，建立葡萄酒中常用防腐劑和甜味劑的快速測定的技術(shù)，能夠在大多實驗室得以普及。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

甲醇（色譜純）：德國Merck公司；乙酸銨（分析純）、乙酸鋅（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、NaOH（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為超純水；苯甲酸、山梨酸、安賽蜜（乙?；前匪徕洠簢覙藴饰镔|(zhì)研究中心；脫氫乙酸（純度≥99.9%）、阿斯巴甜（天門冬酰苯丙氨酸甲酯）（純度≥99%）：美國色譜科公司。

1.1.2 溶液的配制

220 g/L乙酸鋅溶液：稱取220 g乙酸鋅于燒杯中，加入800 mL純水溶解，最后純水定容至1 L。

106 g/L亞鐵氰化鉀溶液：稱取106 g亞鐵氰化鉀于燒杯中，加入800 mL純水溶解，最后純水定容至1 L。

40 g/L NaOH溶液：稱取40 g NaOH于燒杯中，加入800 mL純水溶解，最后加水定容至1 L。

脫氫乙酸標準儲備液：稱取0.05 g脫氫乙酸于5 mL容量瓶中，用甲醇/水（5∶95）定容至刻度，得質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的脫氫乙酸標準儲備液，置于4 ℃冰箱中保存。

阿斯巴甜標準儲備液：稱取0.1 g阿斯巴甜于10 mL容量瓶中，用甲醇/水（50∶50）定容至刻度，得質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的阿斯巴甜標準儲備液，置于4 ℃冰箱中保存。

苯甲酸標準儲備液（GBW（E）100006）、山梨酸標準儲備液（GBW（E）100007）、安賽蜜標準儲備液（GBW（E）1000171）質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e-2695高效液相色譜儀：美國Waters公司，配備二級管陣列（diode array，DA）紫外可見光檢測器；AWJ2b-10-U型艾科浦U系列純化水機：渝欽實業(yè)上海有限公司；0.22 μm水相過濾器：上海安普科學儀器有限公司；HH-S型電熱恒溫水浴鍋：江蘇省醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品的處理方法

稱取約5 g混合均勻的葡萄酒樣品（精確至0.001 g）于蒸發(fā)皿中，沸水浴加熱去除乙醇，然后用純水少量多次地轉(zhuǎn)移到50 mL比色管中，加入1 mL乙酸鋅溶液與1 mL亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至中性，加水定容并混勻。將樣品轉(zhuǎn)移入離心管中以3 000 r/min 離心5 min，取上清液過0.45 μm水相濾膜后上機測定。

1.3.2 色譜的條件

色譜柱：Sun FireTMC18色譜柱（4.6mm×250mm，5 μm）；紫外檢測波長：230 nm、209 nm；柱溫：25 ℃；流動相：甲醇/乙酸銨（0.02 mol/L）溶液組成，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。

梯度洗脫程序：0～10 min，甲醇8%～40%；10～12 min，甲醇40%～60%；12～14 min，甲醇60%～8%；14～20 min，甲醇8%。

1.3.3 混合標準使用液的配制

分別準確吸取質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、脫氫乙酸標準儲備溶液1.00 μL、5.00 μL、10.00 μL、20.00 μL、50.00 μL于1 mL上樣瓶中，再準確加入質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL阿斯巴甜標準儲備溶液5.00 μL、25.00 μL、50.00 μL、100.00 μL、250.00 μL，各加水定容至1 mL得到含苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、脫氫乙酸標準質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.00 μg/mL、20.00 μg/mL、50.00 μg/mL，阿斯巴甜標準質(zhì)量濃度為5.00 μg/mL、25.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100.00 μg/mL、250.00 μg/mL的混合標準質(zhì)量濃度。

1.3.4 樣品的測定

以自動進樣器取樣品處理液20 μL進樣，按高效液相色譜條件分析，以保留時間定性，根據(jù)外標法以峰面積定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器對5種添加劑在190～400 nm之間進行三維光譜掃描，安賽蜜、苯甲酸、脫氫乙酸、山梨酸、阿斯巴甜的最大吸收波長分別在226 nm、223 nm、229 nm、252 nm、208 nm處。經(jīng)過反復(fù)試驗，綜合考慮到各組分的靈敏度、基體干擾等因素，最終選定安賽蜜、苯甲酸、脫氫乙酸、山梨酸的檢測波長為230 nm，阿斯巴甜的檢測波長為209 nm，在此波長條件下，5種食品添加劑分離度效果好、基線穩(wěn)定、靈敏度高、穩(wěn)定性好。

2.2 流動相的選擇

圖1 安賽蜜、苯甲酸、脫氫乙酸、山梨酸(A)及阿斯巴甜(B)混合標準色譜圖Fig.1 Standard chromatogram of acesulfame,benzoic acid,dehydroacetic acid,sorbic acid(A)and aspartame(B)

以甲醇-乙酸銨（8∶92）的流動相進行等度洗脫，發(fā)現(xiàn)5種添加劑在色譜柱上保留時間比較集中，脫氫乙酸和阿斯巴甜發(fā)生重合，不能完全分離。于是又選擇了甲醇/乙酸銨（15∶85）、甲醇/乙酸銨（39∶61）2種流動相，發(fā)現(xiàn)隨著甲醇比例的增大，幾個物質(zhì)在色譜柱上的保留時間均縮短，其中安賽蜜、苯甲酸和山梨酸在色譜柱上保留時間相對穩(wěn)定，而阿斯巴甜和脫氫乙酸的保留時間改變的相對比較大，并且仍然重合在一起。經(jīng)過反復(fù)的試驗，最終確定了梯度洗脫程序：0～10 min，甲醇8%～40%；10～12 min，甲醇40%～60%；12～14 min，甲醇60%～8%；14～20 min，甲醇8%。在此條件下，5種物質(zhì)能夠很好地分開，峰型好，安賽蜜、苯甲酸、脫氫乙酸、山梨酸色譜圖見圖1A，阿斯巴甜色譜圖見圖1B。

2.3 線性范圍，檢出限和定量限

按實驗方法對混合標準溶液系列進行測定，以峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸，繪制標準曲線。回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。由表1可以看出，5種物質(zhì)在這種分離條件下，相關(guān)系數(shù)均＞0.999 0。根據(jù)國際理論和應(yīng)用化學聯(lián)合會（international union of pure and applied chemistry，IUPAC）規(guī)定的3倍噪音為樣品的檢出限，本方法5種物質(zhì)的檢出限在0.3～1.5 mg/L之間。

表1 5種物質(zhì)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)Table 1 Regression equation and correlation of 5 components

2.4 樣品加標回收率和精密度試驗

表2 5種物質(zhì)的回收率和精密度試驗結(jié)果(n=6)Table 2 Results of the recovery rate and accuracy tests of 5 components(n=6)

對葡萄酒樣品進行低、中、高3水平加標回收試驗，每個添加水平取6個平行樣，按照試驗方法對樣品進行前處理，計算平均加標回收率和精密度。結(jié)果如表2所示。由表2可知，5種物質(zhì)的加標回收率在87.3%～110.0%之間，測定結(jié)果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.5%～3.6%，說明實驗的準確度和精密度較高，準確度和精密度符合實際樣品的檢測要求。

2.5 實際樣品的測定

按該實驗方法對市售4種葡萄酒樣品進行測定，結(jié)果均未檢出這5種添加劑。

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜法同時測定葡萄酒中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和阿斯巴甜5種添加劑的分析條件，最終在230 nm和209 nm的紫外檢測波長下，經(jīng)過1.0 mL/min甲醇和乙酸銨（0.02 mol/L）溶液的梯度淋洗，5種添加劑得到的很好的分離。結(jié)果表明，該方法加標回收率87.3%～110.0%，相對偏差為0.5%～3.6%，該方法靈敏度高、精密度好、準確度高，符合檢測要求。同時，操作簡單便捷，5種添加劑在20 min內(nèi)就能夠完全分離，達到日常測定樣品的要求。

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