響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取桑葚花色苷工藝的研究

程秀瑋，魏 瑋

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物化工系，天津 300350）

花色苷（anthocyanin）是一類廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等器官的細(xì)胞液中的天然的水溶性色素?；ㄉ帐怯苫ㄉ剀张浠ㄜ赵┡c各種糖通過(guò)糖苷鍵結(jié)合而成的一類黃酮多酚類化合物，使植物胞呈現(xiàn)出紅色、藍(lán)色或紫色等顏色[1-3]。

花色苷作為一種天然色素，安全、無(wú)毒，資源豐富，且對(duì)人體具有許多保健功能，如清除體內(nèi)自由基、抗炎、抗癌、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和預(yù)防糖尿病、保護(hù)視力等。因此，花色苷現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)。

桑葚有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，成熟的桑椹果營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的活性蛋白、維生素、氨基酸、胡蘿卜素、礦物質(zhì)、白藜蘆醇、花青素等成份，其營(yíng)養(yǎng)是葡萄的4倍、蘋果的5～6倍，具有提高人體免疫力、延緩衰老、促進(jìn)造血細(xì)胞生長(zhǎng)、防止動(dòng)脈硬化、促進(jìn)新陳代謝等多種功能[4]。由于桑葚成熟的季節(jié)性很強(qiáng)，且外無(wú)果皮，水分含量少，不耐碰撞，易霉變，桑葚果實(shí)不易儲(chǔ)藏、運(yùn)輸。因此，開(kāi)發(fā)桑葚果實(shí)深加工技術(shù)不僅可解決桑葚的貯存、保鮮問(wèn)題，還可增加桑葚果實(shí)的綜合利用，增加產(chǎn)品附加值，擴(kuò)大產(chǎn)品消費(fèi)領(lǐng)域。

超聲波提取技術(shù)利用其空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)作用、熱效應(yīng)等破壞植物細(xì)胞壁，使有效成分迅速溶解到溶劑里，提高了有效成分的提取得率，縮短了提取時(shí)間，減少了高溫對(duì)提取成分的影響[5-7]。本文對(duì)超聲波輔助提取桑葚花色苷的工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，選擇出最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚：市購(gòu)；鹽酸、無(wú)水乙醇、Na2HPO4、NaH2PO4、氯化鉀等均為國(guó)產(chǎn)分析純：天津科密歐試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器有限公司；AB204-S型電子分析天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；KQ-250DB超聲波發(fā)生器：昆山市超聲儀器有限公司；HH2電熱恒溫水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司、DT5A低速臺(tái)式離心機(jī)：金山市科析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚花色苷提取

新鮮桑葚→洗凈→研磨成漿→加入一定量酸化乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)85%乙醇，含0.4%HCl）→超聲波抽提（20 min，50 ℃，430 W）→離心（3 000 r/min、10 min）→取上層清液為待測(cè)原液。

1.3.2 桑葚花色苷含量測(cè)定方法

花青苷含量測(cè)定采用pH示差法[8-10]。依據(jù)pH示差法的原理取0.025 mol/L（pH 1.0）的氯化鉀緩沖液和0.4 mol/L（pH 4.5）的乙酸鈉緩沖液各5 mL分別加入1 mL的待測(cè)樣品，混勻，室溫下避光平衡30 min，用蒸餾水作空白，在矢車菊素-3-葡萄糖苷最大吸收波長(zhǎng)510 nm和700 nm（校正渾濁度）下，測(cè)定吸光度值，稀釋樣品的吸光度值以及原始樣品中花青苷含量按如下公式計(jì)算：

式中：TAcy為桑葚花色苷含量，mg/g；V為提取液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子質(zhì)量，449.2；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26900；A為樣品的吸光度值；m為原料的質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

稱取果漿3.0 g，采用酸性乙醇作為浸提溶劑，以桑葚花色苷含量為考察指標(biāo)，依次對(duì)其進(jìn)行超聲時(shí)間、料液比、超聲溫度及超聲功率的單因素試驗(yàn)。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法進(jìn)行3因素3水平的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)超聲波提取桑葚花色苷的條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)桑葚花色苷提取的影響

圖1 超聲時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on anthocyanin content

稱取3.0 g果漿，按料液比1∶15加入體積分?jǐn)?shù)85%乙醇（含0.4%HCl）浸提溶劑，在40 ℃下，以300 W功率超聲條件分別提取10 min、15 min、20 min、25 min、30 min后，抽濾、離心（3 000 r/min、10 min）取1 mL上清液，測(cè)定其吸光度值A(chǔ)，計(jì)算花色苷含量，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，超聲提取時(shí)間從10 min增加到20 min，桑葚花色苷含量逐漸增大[11]，并于20 min達(dá)到最大值；繼續(xù)增加超聲波提取時(shí)間至30 min，花色苷提取率逐漸降低，因此，超聲時(shí)間宜控制在20 min。

2.1.2 料液比對(duì)桑葚花色苷提取的影響

稱取3.0 g果漿，分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)85%乙醇（含0.4% HCl）浸提溶劑，在40 ℃下，以300 W功率超聲波提取20 min后，抽濾、離心（3 000 r/min、10 min），取1 mL上清液，測(cè)定其吸光度值A(chǔ)，計(jì)算花色苷含量，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，隨著料液比的增加，花色苷含量呈現(xiàn)出單一性增長(zhǎng)的變化趨勢(shì)，但料液比從1∶10（g∶mL）增加到1∶20（g∶mL），花色苷含量變化非常大，而從1∶20（g∶mL）繼續(xù)增大到1∶30（g∶mL），含量雖然增加，但變化非常小。因此，考慮料液比過(guò)大，反應(yīng)體系較濃稠，不利于花色苷的溶出以及試驗(yàn)材料的成本問(wèn)題，料液比為1∶20（g∶mL）較適宜。

圖2 料液比對(duì)花色苷含量的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on anthocyanin content

2.1.3 超聲溫度對(duì)桑葚花色苷提取的影響

圖3 超聲溫度對(duì)花色苷含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperatue on anthocyanin content

稱取3.0 g果漿，按料液比1∶20（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)85%乙醇（含0.4%HCl）浸提溶劑，分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃下，以300 W功率超聲波提取20 min后，抽濾、離心（3 000 r/min、10 min），取1 mL上清液，測(cè)定吸光度值A(chǔ)，計(jì)算花色苷含量，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)超聲溫度從20 ℃升高到50 ℃，桑葚花色苷含量逐漸增大，并于50 ℃達(dá)到最大值；繼續(xù)升高溫度，含量反而下降，可能是由于色素在高溫條件下逐步降解的緣故，因此，溫度宜控制在50 ℃。

2.1.4 超聲功率對(duì)桑葚花色苷提取的影響

稱取3.0 g果漿，按料液比1∶20（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)85%乙醇（含0.4%HCl）浸提溶劑，在50 ℃下，分別以250 W、300 W、350 W、400 W、450 W、500 W功率超聲波提取20 min后，抽濾、離心（3 000 r/min、10min），取1 mL上清液，測(cè)定吸光度值A(chǔ)，計(jì)算花色苷含量，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)超聲功率從250 W增大到400 W，桑葚花色苷的含量逐漸增大，并且在超聲功率為400 W時(shí)，含量達(dá)最大值，此后繼續(xù)增大超聲功率，含量開(kāi)始出現(xiàn)下降的變化趨勢(shì)，這可能是由于功率過(guò)大，反應(yīng)體系內(nèi)局部產(chǎn)生熱量過(guò)高[12]，引起花色苷降解，降低了提取效果。因此，適宜的超聲功率應(yīng)控制在350～450 W范圍內(nèi)。

圖4 超聲功率對(duì)花色苷含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on anthocyanin content

2.2 以桑葚花色苷含量為響應(yīng)值的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)方案

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，超聲功率、超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)花色苷提取的影響均表現(xiàn)為隨著超聲功率、超聲溫度和超聲時(shí)間的增長(zhǎng)，花色苷含量出現(xiàn)不同程度的先增長(zhǎng)后下降的變化趨勢(shì)；而料液比對(duì)花色苷提取的影響則表現(xiàn)為隨著料液比在一定范圍內(nèi)的增大，花色苷的含量則只呈現(xiàn)出單一性增長(zhǎng)的變化趨勢(shì)，故不將料液比作為優(yōu)化設(shè)計(jì)考察因素。

因此，根據(jù)Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[13-14]，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取超聲波功率、超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)花色苷含量影響顯著的3個(gè)因素，以桑葚花色苷含量（Y）為考察指標(biāo)，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法[15]，因素與水平見(jiàn)表1。

表2中1～12為析因試驗(yàn)，13～17為中心試驗(yàn)。17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有12個(gè)析因點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis experiment

表2 花色苷提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

2.2.2 回歸方程和方差分析

采用Design Expert 7.0 軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析得到花色苷含量與各因素變量的多元二次方程模型為：Y=5.76-0.036A+0.028B+0.046C+0.030AB+0.097AC-0.020BC-0.28A2-0.12B2-0.039C2

從表3二次響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果可知，模型的P＜0.000 1，說(shuō)明對(duì)桑葚花色苷超聲波提取建立的回歸模型是極顯著的；失擬項(xiàng)P=0.161 6＞0.05不顯著，模型在整個(gè)回歸區(qū)域的擬合度很好；變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=0.61%，較低，表明該模型精確度高，試驗(yàn)可信；模型決定系數(shù)R2=0.984 1，校正系數(shù)R2Adj=0.963 6，表示模型的擬合度良好，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間具有高度相關(guān)性，試驗(yàn)誤差較?。恍旁氡?19.113＞4，表明該模型擬合度與可信度均較高。因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

將二次回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值大小作為各參數(shù)對(duì)花色苷含量影響的比較依據(jù)，得出3因素對(duì)花色苷含量影響的大小依次為：C＞A＞B，即超聲功率、超聲時(shí)間和超聲溫度。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 響應(yīng)面曲面分析

圖5 各因素交互作用對(duì)花色苷含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of interaction among each factors on the yield of melberry anthocyanin

為進(jìn)一步探究A、B、C的交互作用對(duì)響應(yīng)值Y的影響，采用Design-Expert軟件繪制了三維響應(yīng)曲面圖（見(jiàn)圖5），從圖5可看出AC交互作用對(duì)桑葚花色苷提取影響極顯著，而且隨著超聲功率的增加和超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，AB、BC交互作用對(duì)含量的影響作用較小。

利用Design Expert 軟件分析，當(dāng)花色苷含量即響應(yīng)值（Y）為最大值時(shí)，與其相對(duì)應(yīng)的桑椹花色苷的最佳提取條件為：超聲時(shí)間20.24 min，超聲溫度50.34 ℃，超聲功率431.60 W，理論最佳花色苷含量為5.770 7 mg/g。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證響應(yīng)面分析結(jié)果的可行性，采用響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝條件，進(jìn)行了超聲波輔助提取桑葚花色苷的驗(yàn)證試驗(yàn)?？紤]到操作的便利性，將提取條件修正為：提取時(shí)間20 min，提取溫度50 ℃，超聲功率430 W。平行3次，花色苷的實(shí)際平均含量為5.768 1 mg/g，與預(yù)測(cè)值基本相符，說(shuō)明響應(yīng)面法對(duì)超聲波提取桑葚花色苷條件的優(yōu)化是可行的。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面分析方法應(yīng)用于超聲波輔助提取桑葚花色苷的條件優(yōu)化?；貧w分析結(jié)果表明，超聲溫度對(duì)超聲波提取花色苷得率的影響最顯著?；貧w分析和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，此方法合理可行。得到超聲波提取花色苷的最佳條件為：超聲時(shí)間20 min，超聲溫度50 ℃，超聲功率430 W，花色苷的實(shí)際含量為5.768 1 mg/g。

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