梔子苷的精制純化研究

蔣 威，徐 旭，景艷艷，楊 贊，方尚玲*

（湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068）

梔子是茜草科（Rubiaceae）梔子屬（Gardenia）植物，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒的作用，外治扭挫傷[1-2]。近年來(lái)對(duì)梔子苷的研究表明，其在消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及抗炎、抗腫瘤、降血糖方面具有廣泛的藥理作用[3-6]。

大孔吸附樹(shù)脂是一類不帶離子交換基團(tuán)的多孔性交聯(lián)聚合物吸附劑，具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比面積，對(duì)化學(xué)物質(zhì)的分離作用主要由其吸附選擇性產(chǎn)生，對(duì)單味中藥提取物中苷類成分、黃酮、生物堿的分離效果良好，有的已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[7-9]。

目前，梔子中梔子苷的提取和純化方法多為水提醇沉法。本實(shí)驗(yàn)以提取梔子黃之后的廢液為原料，利用大孔吸附樹(shù)脂富集，以較簡(jiǎn)便的方法得到較高純度的梔子苷產(chǎn)品，有利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子：市售；梔子苷廢液：利用梔子果提取梔子黃時(shí)產(chǎn)生的廢液；梔子苷對(duì)照品：中國(guó)生物制品檢定所，批號(hào)20 140122；大孔樹(shù)脂X-5、AB-8、HPD-400、D3520、D1300、NKA：鄭州勤實(shí)科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2201PC型紫外-可見(jiàn)分光掃描儀：日本島津公司；EV-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樹(shù)脂靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

（1）樹(shù)脂的預(yù)處理

樹(shù)脂預(yù)處理方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[10]。

（2）靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11]。

靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)吸附率及解吸率的計(jì)算公式為：

式中：A1為吸附前梔子苷粗提液在238 nm處的吸光度值，A2為吸附平衡后梔子苷粗提液在238 nm處的吸光度值，A3為解吸后體積分?jǐn)?shù)30%乙醇中梔子苷粗提液在238 nm處的吸光度值。

1.3.2 樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

（1）樹(shù)脂的預(yù)處理

樹(shù)脂預(yù)處理方法同上。

（2）動(dòng)態(tài)吸附流速確定研究

分別以1.0 mL/min、1.5 mL/min、2.0mL/min、2.5mL/min、3.0 mL/min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。當(dāng)達(dá)到吸附平衡時(shí)，流出液的吸光度值不再變化，記錄上樣液和流出液體積，測(cè)定總流出液和樣液的吸光度值，吸附量計(jì)算公式如下：

式中：V樣為上樣液體積，mL；V流流出液體積為，mL；A流為總流出液的吸光度值；A樣為樣液的吸光度值；V柱為樹(shù)脂床體積，mL。

（3）不同濃度梔子廢液對(duì)樹(shù)脂吸附率的研究

各取120 mL（3BV）不同濃度梔子苷廢液（稀釋5、10、15、20、25倍）上柱，確定流速動(dòng)態(tài)吸附，分別收集流出液，在238 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)238nm，確定最佳梔子苷廢液濃度，吸附率計(jì)算公式如下：

式中：A0為梔子苷上樣液238 nm處吸光度值，V0為上樣體積，mL；A1為流出液在238 nm處吸光度值，V1為流出液體積；mL。

（4）泄漏曲線的繪制

上述條件下將梔子廢液上柱吸附，每20 mL流出液收集一份，以每份流出液在238 nm波長(zhǎng)處的吸光度值為縱坐標(biāo)，以流出液編號(hào)為橫坐標(biāo)，繪制泄漏曲線。

1.3.3 動(dòng)態(tài)洗脫實(shí)驗(yàn)

（1）不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)樹(shù)脂的影響

分別用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)吸附飽和的樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，每20 mL流出液收集一份，分別測(cè)定其在238 nm波長(zhǎng)處的吸光度值A(chǔ)238nm，以流出液的編號(hào)為橫坐標(biāo)，以每份流出液在238 nm波長(zhǎng)處的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫曲線。

（2）不同流速對(duì)樹(shù)脂洗脫的影響

以確定乙醇體積分?jǐn)?shù)作為洗脫劑，分別采用不同的流速對(duì)梔子苷洗脫，實(shí)驗(yàn)步驟同上，繪制不同流速洗脫曲線。

（3）動(dòng)態(tài)洗脫曲線的繪制

以確定上樣液濃度，流速，吸附量條件下得到已經(jīng)飽和樹(shù)脂，再以上述確定洗脫流速，用2BV去離子水除去水溶性雜質(zhì)，用確定乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行洗脫，實(shí)驗(yàn)步驟同上，繪制動(dòng)態(tài)洗脫曲線。收集同一吸收峰吸光度值高的各管洗脫液，分別合并，減壓濃縮、真空干燥，測(cè)定梔子苷的含量。

1.3.4 梔子苷的濃縮與干燥

文言文教學(xué)固然存在或多或少的問(wèn)題。如何認(rèn)清問(wèn)題的存在，很好地解決問(wèn)題是當(dāng)下急需重視的內(nèi)容。只有解決好這些問(wèn)題，才能更好地指導(dǎo)文言文教學(xué)實(shí)踐。

（1）真空蒸發(fā)濃縮

使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將精制后的梔子苷減壓濃縮除去大量乙醇和部分水分。

（2）低溫干燥

將濃縮后的梔子苷置于50 ℃干燥箱內(nèi)24 h，得淡黃色粉末梔子苷。

1.3.5 梔子苷含量的測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用紫外分光光度法，精密稱取梔子苷對(duì)照品5.1 mg，溶解于體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇中，定容于25 mL容量瓶中，精密移取0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL于10 mL容量瓶中，分別加體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇稀釋定容至刻度，以體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇為空白，于238 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)238nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程[12]。

（2）樣品測(cè)定

2 結(jié)果與討論

2.1 靜態(tài)吸附樹(shù)脂篩選實(shí)驗(yàn)

以不同樹(shù)脂對(duì)梔子苷不同的吸附率和解吸率為標(biāo)準(zhǔn)，篩選對(duì)其吸附能力及解吸能力強(qiáng)的樹(shù)脂，選擇6種樹(shù)脂進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 不同型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂對(duì)梔子苷的吸附解吸性能比較Table 1 Absorption and desorption performance of different types of macroporous resin for gardenoside

由表1可知，D1300樹(shù)脂吸附率和解吸率均大于其他樹(shù)脂，因此，在后續(xù)研究中確定D1300型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)梔子苷進(jìn)行精制純化。

2.2 動(dòng)態(tài)吸附最佳條件的確定

2.2.1 不同流速對(duì)樹(shù)脂吸附量的影響

分別以1.0 mL/min、1.5 mL/min、2.0 mL/min、2.5 mL/min、3.0 mL/min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，流速對(duì)樹(shù)脂吸附量的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 流速對(duì)樹(shù)脂吸附量的影響Fig.1 Effects of sample velocity on adsorption capacity

由圖1可知，隨著流速的增加，樹(shù)脂吸附量逐漸降低，不利于樹(shù)脂的吸附。雖然流速為1.0 mL/min時(shí)，樹(shù)脂的吸附量最大，但是低流速會(huì)延長(zhǎng)吸附時(shí)間，同時(shí)滯留在樹(shù)脂中的雜質(zhì)也會(huì)增多；而高流速下樹(shù)脂吸附量下降太快，綜合考慮，確定1.5 mL/min為最佳吸附流速。

2.2.2 上樣液濃度對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響

以1.5mL/min為吸附流速，各取120 mL（3BV）不同濃度梔子苷廢液（在238 nm處吸光度值分別為1.372 9、1.683 0、2.293 0、3.150 3上柱，上樣液濃度對(duì)樹(shù)脂吸附量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 上樣液濃度對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響Fig.2 Effects of sample concentration on adsorption rate

由圖2可知，梔子苷濃度越低越利于吸附，但是濃度過(guò)低，樹(shù)脂吸附雜質(zhì)越多，增加了分離難度。當(dāng)梔子苷廢液吸光度值A(chǔ)238nm=1.683時(shí)，樹(shù)脂吸附率降低幅度不大，故選擇梔子苷廢液吸光度值A(chǔ)238nm=1.683作為最佳上樣液濃度。

2.2.3 吸附泄漏曲線的制作

以1.5 mL/min為吸附流速，以梔子苷廢液吸光度值A(chǔ)238nm=1.683為樣液濃度上柱吸附，每20 mL流出液收集一份，以每份流出液在238 nm波長(zhǎng)處的吸光度值為縱坐標(biāo)，以流出液編號(hào)為橫坐標(biāo)，吸附泄漏曲線見(jiàn)圖3。

圖3 梔子苷的吸附泄露曲線Fig.3 Leakage adsorption curve of geniposide

由圖3可知，當(dāng)收集到第12份時(shí)，梔子苷開(kāi)始泄露，所以梔子苷廢液（A238nm=1.683）的飽和吸附容量為12×20 mL，即12 BV（樹(shù)脂柱體積為20 mL）。

2.3 最佳洗脫條件的確定

2.3.1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)樹(shù)脂洗脫的影響

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)樹(shù)脂洗脫的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on elution rate

由圖4可知，體積分?jǐn)?shù)為40%、50%乙醇洗脫效果最好，體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇其次，體積分?jǐn)?shù)為10%、20%乙醇洗脫效果最差。但是乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，會(huì)將梔子廢液中的梔子色素洗脫下來(lái)[13-15]，且體積分?jǐn)?shù)為40%，50%乙醇洗脫時(shí)存在拖尾現(xiàn)象，而體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇洗脫曲線窄，不存在拖尾現(xiàn)象，故選擇體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇作為洗脫劑。

2.3.2 不同流速對(duì)樹(shù)脂洗脫的影響

以體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇作洗脫劑，分別以1.0 mL/min、1.5 mL/min、2.0 mL/min、2.5 mL/min、3.0 mL/min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫實(shí)驗(yàn)。流速對(duì)樹(shù)脂洗脫的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，低流速有利于梔子苷的洗脫，但低流速洗脫時(shí)所花時(shí)間也越長(zhǎng)，同時(shí)增加了洗脫液中的雜質(zhì)；流速過(guò)高，洗脫劑與樹(shù)脂接觸不完全，洗脫效果差，綜合考慮，選擇2 mL/min為最適洗脫速率。

圖5 洗脫流速對(duì)洗脫率的影響Fig.5 Effect of elution rate on elution rate

2.3.3 動(dòng)態(tài)洗脫曲線的繪制

以1.5 mL/min為吸附流速，以梔子苷廢液吸光度值A(chǔ)238nm=1.683為樣液濃度上柱吸附，得到飽和樹(shù)脂；再以2 mL/min洗脫流速，用2BV去離子水除去水溶性雜質(zhì)，用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇進(jìn)行洗脫，動(dòng)態(tài)洗脫曲線見(jiàn)圖6。

圖6 動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.6 Dynamic elution curve

由圖6可知，梔子苷洗脫高峰相對(duì)集中，體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇2.5～6.5 BV時(shí)，梔子苷含量最高，當(dāng)洗脫液＞7.0 BV時(shí)，梔子苷含量明顯減少。收集體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇2.5～6.5 BV洗脫液，減壓濃縮，真空干燥，得到精制梔子苷。

2.4 梔子苷含量的測(cè)定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用紫外分光光度法，于238 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=9.670 4x+0.038 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.990 6，表明線性關(guān)系良好。

2.4.2 樣品測(cè)定

精密稱取5.1 mg干燥的樣品（經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附、洗脫、濃縮、干燥后的梔子苷粉末），置于25 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶解，并定容到25 mL容量瓶中，精確吸取1 mL于10 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇定容至刻度，以體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇作為空白，于238 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值為0.436 5，計(jì)算得到梔子苷粉末中梔子苷含量為82.23%。

3 結(jié)論

根據(jù)以上研究和分析，確定梔子苷精制樹(shù)脂的最佳條件：大孔吸附樹(shù)脂選擇D1300，上樣液梔子苷廢液的吸光度值A(chǔ)238nm為1.683 0，吸附流速為1.5 mL/min，吸附飽和量為12BV，洗脫流速為2 mL/min，梯度洗脫，2BV水洗，4BV體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇洗脫。收集體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇洗脫液，濃縮干燥后得到純度為82.23%的固態(tài)梔子苷產(chǎn)品。該實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，材料便宜，產(chǎn)品純度比較高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。大孔樹(shù)脂吸附純化的工藝參數(shù)較多，如樣液上柱前的凈化方法、樹(shù)脂徑高比等有待進(jìn)一步研究。

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