p65小干擾RNA對人臍靜脈內(nèi)皮細胞再灌注后趨化因子CXCL16表達的影響

曾 敏，魏 欣，李 偉，符秀虹，蒙緒卿，陳積雄，王 萍

炎癥反應(yīng)是缺血再灌注細胞損傷的重要環(huán)節(jié)，其中許多黏附因子和趨化因子都有參與。近年來，越來越多的研究顯示趨化因子CXCL16參與了心血管疾病的炎癥反應(yīng)。內(nèi)皮細胞處于血管最內(nèi)層，對于冠狀動脈的缺血缺氧、內(nèi)環(huán)境的微小變化最敏感、最迅捷。因此，本研究選擇人臍靜脈內(nèi)皮細胞作為研究對象，通過對其進行體外模擬缺血再灌注培養(yǎng)，并采用小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染的方法探討缺血再灌注中趨化因子CXCL16的表達及可能的調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1．1 材料和試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細胞 (HUVEC)(購自ATCC)，采用添加了內(nèi)皮細胞生長物、5%胎牛血清和青/鏈霉素的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng) (購自美國科學細胞研究實驗室)，siRNA〔美國Santa cruz公司 (sc-29410)〕，Lipofectamine RNAiMAX、Trizol試劑 (美國Invitrogen公司)，iScriptTMcDNA合成試劑盒 (BIORAD公司)，CXCL16 ELISA試劑盒 (美國R＆D Systems公司)，SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司)。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養(yǎng) 將HUVEC復蘇后轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶，加入內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中，置于37℃、5%二氧化碳(CO2)條件下孵箱內(nèi)培養(yǎng)，5～7 d傳代1次，采用0．25%胰蛋白酶消化細胞。

1．2．2 實驗分組 分為4組:(1)對照組:正常內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)+siRNA陰性對照轉(zhuǎn)染;(2)缺血再灌注組:模擬缺血培養(yǎng)液培養(yǎng)30 min后換正常培養(yǎng)液再培養(yǎng)4 h+siRNA陰性對照轉(zhuǎn)染;(3)p65 siRNA轉(zhuǎn)染組:正常內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)+p65 siRNA轉(zhuǎn)染;(4)缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組:模擬缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染 (對HUVEC轉(zhuǎn)染p65 siRNA 48 h后再模擬缺血再灌注培養(yǎng))。

1．3 模擬缺血再灌注培養(yǎng) 將HUVEC培養(yǎng)在包含118 mmol/L氯化鈉、24 mmol/L碳酸氫鈉、1．0 mmol/L磷酸鈉、2．5 mmol/L氯化鈣、1．2 mmol/L氯化鎂、20 mmol/L乳酸鈉、16 mmol/L氯化鉀、10 mmol/L 2-脫氧葡萄糖 (pH調(diào)至6．2)的“缺血液”中30 min，然后換為再灌注液即正常培養(yǎng)基進行“再灌注”4 h而實現(xiàn)。

1．4 p65 siRNA轉(zhuǎn)染 預設(shè)計好并經(jīng)驗證的核因子κB p65特異性siRNA和不與人類任何編碼基因序列一致的對照siRNA均購自Santa cruz公司。將HUVEC接種于6孔板中，每孔2．0×105個細胞，使其在轉(zhuǎn)染細胞密度30% ～50%融合。于300μl的無血清、無抗生素Opti-MEM中稀釋3．6μl p65 siRNA，混勻。于300μl的無血清、無抗生素Opti-MEM中稀釋6μl轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX(終濃度為20 nmol/L)，混勻。再將兩者混勻，常溫下孵育15 min，轉(zhuǎn)染48 h后檢測。收獲細胞前再根據(jù)實驗需要進行模擬“缺血再灌注”培養(yǎng)。

1．5 核因子κB p65和CXCL16 mRNA實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng) (RT-PCR)檢測 用Trizol試劑盒抽提細胞總RNA。實時定量RT-PCR使用iScriptTMcDNA合成試劑盒。18 S rRNA作為內(nèi)對照。實時定量采用SYBR Premix Ex Taq和iQ5實時定量RT-PCR檢測系統(tǒng)(BioRad)。核因子 κB p65上游引物:5′-CCTGGAGCAGGCTATCAGTC-3′， 下 游 引 物:5′-ATCTTGAGCTCGGCAGTGTT-3′;CXCL16 上游引物:5′-AAGCTTCCATTCTTGGCTCA-3′， 下 游 引 物:5′-AAGCTTCCATTCTTGGCTCA-3′;18 S rRNA 上游引物:5′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3′，下游引物:5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3′(引物均由北京三博遠志公司合成)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):mRNA樣品1μg，iScript逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，5×iScript反應(yīng)混合物4μl，加無RNase的雙蒸水至20μl，輕輕振蕩混勻，25℃溫育5 min，42℃溫熱30 min，85℃加熱5 min。實時定量RT-PCR反應(yīng):cDNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2μl，上下游引物各 0．4μl，SYBR預混劑 10μl(寶生物 DRR041A)，DEPC水(Sigma公司)7．2μl。反應(yīng)條件:第一步95℃ 30 s，第二步95℃ 5 s后62℃ 30 s，此步運行40個循環(huán)，第三步55℃ 15 s，此步運行81個循環(huán)。每個樣本3孔，取3批實驗平均值。

1．6 CXCL16的測定 收集各種實驗條件下培養(yǎng)HUVEC的上清液，以1 000 r/min離心5 min(離心半徑8 cm)后再取上清液于-80℃低溫凍存。應(yīng)用CXCL16檢測試劑盒，采用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中CXCL16表達水平，與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。經(jīng)過徹底洗滌后用底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CXCL16呈正相關(guān)。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度 (OD值)，計算樣品濃度。每個樣本3孔，獨立實驗3次取平均值。

1．7 WST-1法檢測細胞存活率 HUVEC按 (7～8)×103/ml濃度接種到96孔板，200μl/孔。每種實驗條件設(shè)3孔，按上述實驗方法進行siRNA轉(zhuǎn)染和模擬缺血再灌注培養(yǎng)后，均更換正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后小心吸棄100μl上清液，加入10μlWST-1液，37℃孵育2 h，震蕩1 min，用全自動酶標儀，波長為450 nm，測定各孔OD值，記錄結(jié)果。整個實驗重復3次。細胞存活率= 〔(處理細胞OD值-本底OD值)/(對照細胞OD值-本底OD值)〕×100%。

1．8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以 (±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 各組核因子κB p65及CXCL16 mRNA相對表達量比較 對照組、缺血再灌注組、p65 siRNA轉(zhuǎn)染組及缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組核因子κB p65及CXCL16 mRNA相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0．05);其中對照組、p65 siRNA轉(zhuǎn)染組及缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組核因子κB p65及CXCL16 mRNA相對表達量較缺血再灌注組均降低，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0．05，見表1)。

2．2 各組上清液CXCL16表達水平比較 對照組、缺血再灌注組、p65 siRNA轉(zhuǎn)染組及缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組CXCL16表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0．05);其中對照組、p65 siRNA轉(zhuǎn)染組及缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組CXCL16表達水平較缺血再灌注組均降低，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0．05，見表2)。

表1 各組核因子κB p65和CXCL16 mRNA相對表達量比較(± s，n=16)Table 1 Comparison of relative expression quantity ofκB p65 and CXCL16 mRNA among various groups

表1 各組核因子κB p65和CXCL16 mRNA相對表達量比較(± s，n=16)Table 1 Comparison of relative expression quantity ofκB p65 and CXCL16 mRNA among various groups

注:與缺血再灌注組比較，*P＜0．05

組別 核因子κB p65 CXCL16對照組 0．14 ±0．29* 1．58 ±0．15*缺血再灌注組 0．69 ±0．21 3．33 ±0．30 p65 siRNA 轉(zhuǎn)染組 0．07 ±0．02* 1．69 ±0．21*缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組 0．18±0．03* 1．87±0．21*F 值0．001 0．001 14．896 69．629 P值

表2 各組上清液CXCL16表達水平比較 ± s，ng/ml，n=16)Table 2 Comparison of supernatant CXCL16 expression levels among various groups

表2 各組上清液CXCL16表達水平比較 ± s，ng/ml，n=16)Table 2 Comparison of supernatant CXCL16 expression levels among various groups

注:與缺血再灌注組比較，*P＜0．05

組別CXCL16對照組 736±39*缺血再灌注組 1 510±68 p65 siRNA轉(zhuǎn)染組 632±45*缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組 547±32*F 值0．001 509．772 P值

2．3 各組細胞存活率比較 各組實驗處理48 h后，WST-1法測定OD值計算細胞存活率。p65 siRNA轉(zhuǎn)染組及缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組細胞存活率較缺血再灌注組均增高，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0．05，見表3)。

3 討論

趨化因子是一組具有趨化作用的細胞因子，CXCL16是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種清道夫受體，表達在血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和血管平滑肌細胞上。是繼CX3CL1之后發(fā)現(xiàn)的第二個能以膜結(jié)合形式和分泌型的可溶性分子存在的趨化因子。除了清道夫受體外，CXCL16還具有趨化激活T細胞、參與樹突細胞與T細胞的相互作用、促進細胞增殖和細胞-細胞間黏附等功能，近年來發(fā)現(xiàn)其在腫瘤［1-2］、動脈粥樣硬化［3］和缺血再灌注損傷［4］中可能起著重要的作用。

表3 各組細胞存活率比較 (±s，%，n=16)Table 3 Comparison of cell survival rates among various cell groups

表3 各組細胞存活率比較 (±s，%，n=16)Table 3 Comparison of cell survival rates among various cell groups

注:與缺血再灌注組比較，*P＜0．05

組別 細胞存活率缺血再灌注組 55±6 p65 siRNA轉(zhuǎn)染組 89±10*缺血再灌注+p65 siRNA轉(zhuǎn)染組 70±9*F 值0．001 22．369 P值

在小鼠肝損傷模型中，肝臟炎癥損傷組織中CXCL16表達水平增高，膜結(jié)合和分泌型CXCL16分別介導了對淋巴細胞的趨化和內(nèi)皮細胞的黏附［5］。而且，在該模型使用抗CXCL16抗體可顯著改善炎癥反應(yīng)、降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、減輕肝損傷，提示CXCL16在組織炎癥損傷中起重要作用。CXCR6是目前所知的CXCL16的惟一受體。CXCR6基因敲除小鼠較野生株有更強的抗缺血再灌注損傷作用，心肌梗死面積小，心功能相對好，反映了CXCL16/CXCR6信號級聯(lián)在缺血再灌注中的心臟保護作用［4］。本研究通過體外對HUVEC進行模擬缺血再灌注培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)模擬缺血再灌注培養(yǎng)能誘導CXCL16 mRNA表達水平上升。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)體外模擬缺血再灌注可刺激p65，p65是參與組成核因子κB的重要亞基，核因子κB是眾所周知的調(diào)控炎癥反應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子。本研究進一步采用siRNA方法來探索是否核因子κB p65參與了缺血再灌注刺激下對CXCL16表達水平的調(diào)節(jié)。RNA干擾 (RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA介導的細胞內(nèi)某特定基因的mRNA發(fā)生特異性降解，從而導致靶基因的表達沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型抑制的現(xiàn)象。因為RNAi技術(shù)能高效、特異地使相應(yīng)基因失活，目前已作為一種簡單有效的替代基因敲除的有力工具［6］。本研究中通過siRNA沉默p65基因，特異性阻斷其分子生物學作用，導致缺血再灌注情況下CXCL16的表達受到抑制，提示核因子κB對CXCL16的調(diào)控作用。WST-1法顯示，模擬缺血再灌注不利于細胞生存，而選擇性沉默p65卻能顯著減少細胞死亡率，提示p65可能通過促炎反應(yīng)等一系列機制促進細胞在缺血再灌注中的損傷。Izquierdo等［7］報道核因子κB可介導CXCL16 mRNA轉(zhuǎn)錄增加促進急性腎損傷中的炎癥反應(yīng)。本研究顯示了模擬缺血再灌注情況下核因子κB介導CXCL16的表達增加，不利于細胞存活。CXCL16可能作為核因子κB的下游分子發(fā)揮作用，即核因子κB可以調(diào)節(jié)CXCL16促炎，反過來，CXCL16也可以通過核因子κB來發(fā)揮炎性效應(yīng)。例如，CXCL16經(jīng)由細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (ERK)/IκB激酶/IκB途徑活化核因子κB，誘導腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達促進炎癥反應(yīng)、加重細胞和組織損傷［8］。此外，CXCL16還可通過Akt/蛋白激酶B(PKB)間接調(diào)節(jié)核因子 κB活化［9］。

總之，使用siRNA下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞p65的表達，可抑制模擬缺血再灌注誘導的內(nèi)皮細胞CXCL16的表達，促進細胞存活。CXCL16參與缺血再灌注損傷的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑十分復雜，其具體機制尚有待于進一步深入研究。

本課題人員貢獻:曾敏負責文章書寫及部分實驗操作;魏欣負責文章修改及部分實驗操作;李偉、符秀虹、蒙緒卿負責實驗指導及部分實驗操作;陳積雄、王萍負責實驗操作。

本研究創(chuàng)新之處:本研究探討核因子 κB、CXCL16促進炎癥反應(yīng)導致缺血再灌注損傷的分子機制，顯示了對人臍靜脈內(nèi)皮細胞進行模擬缺血再灌注培養(yǎng)能誘導CXCL16 mRNA的表達水平;此外，在模擬缺血再灌注中，CXCL16作為核因子κB的下游分子而發(fā)揮作用。

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