直接免疫熒光法對兒童呼吸道病毒感染病原學(xué)檢測的臨床意義

戴淑惠 任小英

（廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，福建 廈門 361003）

直接免疫熒光法對兒童呼吸道病毒感染病原學(xué)檢測的臨床意義

戴淑惠 任小英

（廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，福建 廈門 361003）

目的建立一種快速檢測呼吸道病毒感染的方法，了解兒童呼吸道病毒感染的流行特征。方法采用直接免疫熒光法對2012年8月至2013年7月住院的1801例呼吸道疾病患兒鼻咽部抽吸物進行呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒A、B型、副流感病毒1、2、3型、腺病毒檢測。結(jié)果檢測下呼吸道感染的患兒1801例，共檢出呼吸道病毒766例，檢出率42.5%。呼吸道合胞病毒（RSV）是兒童下呼吸道感染最常見的病原體，嬰幼兒最高，通常在冬春季節(jié)流行。結(jié)論直接免疫熒光法具有快速、簡便、特異性高等優(yōu)點，適應(yīng)于呼吸道病毒感染的早期診斷。

直接免疫熒光法；呼吸道病毒感染；兒童

呼吸道病毒是指一類能侵犯呼吸道并引起呼吸道局部病變的病毒，呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒A、B型、副流感病毒1、2、3型、腺病毒（ADV）感染是多數(shù)急性下呼吸道感染的常見原因[1]。其中，多種病毒具有感染力強，潛伏期短，發(fā)病急等特點，且病原學(xué)復(fù)雜，精確的病原學(xué)分析不僅是確診依據(jù)，也是合理選擇治療方案的基礎(chǔ)[2]，因此能快速檢測呼吸道病毒對臨床及時診斷和疫情報告有重要意義。本文采用Chemicon呼吸道病毒診斷試劑對誘導(dǎo)痰脫落纖毛柱狀上皮細(xì)胞中呼吸道病毒抗原進行染色，從而更加快速和靈敏檢測呼吸道病毒，達到快速診斷、特異性高、敏感性高的目的。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2012年8月至2013年7月在本院確診為下呼吸道感染住院的患兒1801例，年齡1 d～14歲，男1125例，女676例。

1.2 設(shè)備及試劑

熒光顯微鏡（OLYMPUS IX71）、離心機（ALLEGRA X-15R）、37 ℃培養(yǎng)箱，漩渦混合器，美國DHI公司提供的Chemicon呼吸道病毒診斷試劑盒，包括：①熒光標(biāo)志的單克隆抗體：針對RSV、ADV、FLU-A、FLU-B、副流感1、2、3型；②濃縮洗滌液（40X）；③封閉液；④病原體對照玻片：分別含有病毒感染細(xì)胞的陽性對照和沒被感染的細(xì)胞的陰性對照。

1.3 檢測方法

1.3.1 樣本收集與處理：①由專職護士將植絨拭子從鼻孔插入鼻腔，到達鼻咽部，來回旋轉(zhuǎn)2～3次后迅速抽出拭子，放入微生物轉(zhuǎn)運液的試管中。②將植絨拭子樣本在漩渦混勻器上輕微混勻3下（約30 s）見渾濁后去掉植絨拭子，300～500 r/min，離心10 min 。棄去上清液，留約100～150 μL，吸管吹打混勻，形成混濁細(xì)胞懸浮液。

1.3.2 樣本制片：樣本點樣在載玻片上（10～15 μL），電吹風(fēng)機冷風(fēng)下風(fēng)干10～15 min至干燥，浸沒在冷丙酮中固定10 min，取出晾干。

1.3.3 免疫熒光染色：①在標(biāo)本片和對照玻片點加上1滴相應(yīng)的熒光抗體（約25 μL），必須完全覆蓋待測樣本。②將載玻片放在濕盒中置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育15～30 min。③載玻片用PBS沖洗一遍，后浸沒在PBS中洗兩遍（PBS不能重復(fù)使用）。④除去多余的洗液，在載玻片中央加一滴封閉液，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4 診斷原則與判斷標(biāo)準(zhǔn)：①診斷原則：FITC標(biāo)記的某病毒特異性單克隆抗體與細(xì)胞中相應(yīng)的病毒抗原結(jié)合后，形成抗原抗體復(fù)合物，熒光顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)顯示蘋果綠熒光。而未發(fā)生抗原抗體特異性反應(yīng)的細(xì)胞，被Evans藍(lán)染成紅色。②陽性結(jié)果判斷：顯示蘋果綠熒光的細(xì)胞，為陽性細(xì)胞。當(dāng)放大倍數(shù)為200倍時，在視野中找到≥2個陽性細(xì)胞，判為標(biāo)本陽性。不同種類的病毒感染的細(xì)胞在染色上略有差異，具體情況如下，流感病毒A型/流感病毒B型：胞質(zhì)顆粒型；細(xì)胞核均質(zhì)型。呼吸道合胞病毒：胞質(zhì)顆粒型，合胞體中亦可見小塊包涵物染熒光。腺病毒：胞質(zhì)顆粒型；細(xì)胞核均質(zhì)型。副流感病毒1/2/3型：胞質(zhì)顆粒型。

2 結(jié) 果

2.1 病毒檢出率與季節(jié)的關(guān)系

見表1。

表1 病毒檢出率與季節(jié)的關(guān)系

2.2 病毒檢出率與年齡的關(guān)系

見表2。

表2 病毒檢出率與年齡的關(guān)系

3 討 論

呼吸道感染是一種常見病、多發(fā)病，一直影響著人們的身體健康，尤其是對免疫力較為低下的嬰幼兒，病原體感染容易使嬰幼兒引發(fā)支氣管炎、肺炎、心肌炎等。引起呼吸道感染的病原體種類繁多，引起的病情復(fù)雜，臨床癥狀多樣，因此，對于引起呼吸道感染的呼吸道病原體的準(zhǔn)確診斷將變得十分重要。目前診斷病毒感染方法較多，但都存在不足。電鏡檢測雖是直接檢測病毒顆粒，但檢出陽性率不高，檢測時間長，不適合臨床快速診斷。病毒分離能客觀反映所感染病毒的存在及種類，但費時、費力，標(biāo)本內(nèi)所含的病毒數(shù)量少，會出現(xiàn)假陰性，不利于病毒的快速診斷。病毒核酸檢測應(yīng)用雜交或聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，敏感性強，特異性高，能進行微量檢測，但實驗條件要求嚴(yán)格，成本高，不適合廣大基層醫(yī)院，同時，不能避免出現(xiàn)假陽性或假陰性。另外，特異性IgG和IgM抗體檢測是被感染機體對所感染的病毒產(chǎn)生的一類特異性抗體，但特異性IgG抗體陽性只能表明有相應(yīng)病毒感染，卻不能作為病毒感染急性期和活動期的診斷標(biāo)準(zhǔn)。而IgM類抗體是被感染機體在病毒感染早期或潛伏病毒活化時產(chǎn)生的特異性抗體[3]，雖然IgM抗體不能通過胎盤，故無被動抗體存在，但嬰幼兒可因免疫反應(yīng)較弱而出現(xiàn)假陰性。有文獻指出，目前用于診斷呼吸道病毒感染的方法中抗原較抗體檢測更敏感[4]。用免疫標(biāo)記技術(shù)直接檢測體液和組織中病毒抗原是一種快速而實用的方法。這種方法要求標(biāo)本中含有一定量的抗原和高質(zhì)量特異單抗。有報道，選用堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標(biāo)法（APPAAP）[5]，APPAAP法雖然可檢測病毒抗原，但由于操作步驟過多而易出現(xiàn)非特異性著色，陽性結(jié)果很難判斷。而熒光免疫技術(shù)已發(fā)展了二十多年，是一種快速而準(zhǔn)確的方法[6]，本文采用的直接免疫熒光法與以往采用的間接熒光免疫法不同的地方在于，它減少了間接法中二抗的非特異性反應(yīng)，從而提高其特異性。本方法應(yīng)用呼吸道誘導(dǎo)痰進行病毒抗原檢測達到診斷目的。本文的Chemicon呼吸道病毒診斷試劑經(jīng)過WHO3個參考中心審評，結(jié)果良好[7]，特異性可達86%，敏感性達95%[8]。本文結(jié)果得出呼吸道合胞病毒（RSV）是兒童下呼吸道感染最常見的病原體，嬰幼兒最高，通常在冬春季節(jié)流行[9]。本法需時較短，標(biāo)本在送到實驗室2h內(nèi)就可得出結(jié)果，而設(shè)備僅需熒光顯微鏡，在普通實驗室即可開展，是一種快速、簡便、特異性和敏感性高的診斷呼吸道病毒感染的方法

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R725.6

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1671-8194（2014）16-0147-02