新疆北疆部分地區(qū)PCV2的PCR檢測及基因型分析

施研進 楊蓓 屈勇剛* 石家成 黃佐興 楊媛 成池杰 王闖 張新銀

（1石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003；2新疆泰昆集團，新疆昌吉 831100；

3新疆生產(chǎn)建設兵團農(nóng)十師畜牧獸醫(yī)站，新疆北屯 836000；4新疆石河子畜牧獸醫(yī)站，新疆石河子 832000）

新疆北疆部分地區(qū)PCV2的PCR檢測及基因型分析

施研進1楊蓓1屈勇剛1*石家成1黃佐興2楊媛1成池杰3王闖3張新銀4

（1石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003；2新疆泰昆集團，新疆昌吉 831100；

3新疆生產(chǎn)建設兵團農(nóng)十師畜牧獸醫(yī)站，新疆北屯 836000；4新疆石河子畜牧獸醫(yī)站，新疆石河子 832000）

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）是豬源疾病中的主要致病原。為了解新疆北疆部分地區(qū)PCV2的感染情況及陽性毒株基因型。在石河子及北屯地區(qū)的屠宰場共采集了203份抗凝血液，采用PCR方法對血樣進行PCV2檢測，在分離的PCV2陽性毒株中，選取2株克隆、測序，并進行了同源性分析和遺傳進化分析。結果在待檢樣品中，PCV2陽性感染率為7.9%（16/203）；兩個陽性樣品測得序列之間的同源性為100%，它們與PCV2a參照序列之間的同源性為86.4%～87.4%，與PCV2b參照序列之間的同源性為92.9%～96.4%；兩個陽性樣品的序列在構建的遺傳進化樹中與PCV2b參照序列同屬于一個分支，親緣關系較近。結果證實本研究中所獲毒株屬于PCV2b基因型，表明新疆北疆部分地區(qū)豬群中存在PCV2感染，其基因型為2b型。

PCV2；PCR檢測；基因型分析

豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type 2）引起的豬的一種多系統(tǒng)功能障礙性傳染病。豬圓環(huán)病毒2型也是導致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemwasting synd rome，PMWS）的病原體之一，與豬細小病毒（PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等多種引起母豬繁殖障礙的病毒混合感染，加重疾病病情，使治療更為復雜。5～12周齡的仔豬為核心易感群體，其主要癥狀為呼吸困難、貧血、淋巴結病變和進行性消瘦等[1]。

豬單純感染PCV2病毒時，并不一定顯現(xiàn)臨床癥狀，通常在受到豬細小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等其他病原共同感染或受到疫苗免疫刺激時才會導致PCV2發(fā)展為PMWS。通常感染PCV2的豬群PMWS的發(fā)病率為5%～30%，死亡率高達20%～100%[2]。豬圓環(huán)病毒病的危害很大，給養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟損失。本文以在新疆北疆地區(qū)部分屠宰場采集的血液為樣本，使用PCR檢測方法，對PCV2的感染情況進行檢測，為PCV2感染的后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 血液樣品

在新疆石河子及北屯地區(qū)的部分生豬屠宰廠采集抗凝血液共203份，其中石河子地區(qū)采集131份，北屯地區(qū)采集72份。

1.2 主要試劑

血液基因組小量提取試劑盒、PCR擴增試劑2×EsTaq Master Mix、DNA Marker DM2000、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒（均為北京康為世紀生物有限公司產(chǎn)品）；pMD18-T載體由TAKARA公司生產(chǎn)；感受態(tài)大腸桿菌（）DH5α由本實驗室制備。

1.3 PCR引物設計

根據(jù)參考文獻3合成了PCV2檢測引物，用于擴增PCV2的非編碼區(qū)序列，其序列見表1。

表1 PCV 2病毒引物序列

1.4 總DNA的提取

按照北京康為世紀生物有限公司血液基因組提取試劑盒說明書操作。其中提取DNA時，每份血液樣品的用量為300μL，加入三倍體積的Bu ffer GR，其余步驟與操作說明相同。

1.5 PCR擴增

引物選用PCV2F和PCV2R（表1）。PCR反應體系為：2×EsTaq Master Mix 10μL、上游引物0.2μL、下游引物0.2μL、Rnase-free water 7.6μL、DNA模板2μL，總反應體系為20μL。反應條件為：94℃預變性3分鐘，94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。

1.6 PCR產(chǎn)物的鑒定

取PCR產(chǎn)物20μL，用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析，通過凝膠成像儀觀察電泳結果。

1.7 PCR產(chǎn)物的序列測定

PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳、切膠后，通過DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行純化，連接至pMD18-T載體上，轉入感受態(tài)細菌DH5α，通過氨芐抗性進行篩選。陽性克隆菌落經(jīng)PCR進一步鑒定后，保存于50%的滅菌甘油中，送北京華大基因生物技術公司測序。

1.8 基因序列的同源性分析

豬群中流行的PCV2主要為PCV2a、PCV2b兩種基因型。為此，本研究選取GenBank收錄的國內外PCV2a、PCV2b兩種基因型的全序列各3個，作為參照序列用于核酸序列的比較分析（表2）。

表2 PCV2序列分析所用的參照序列及來源

2 結果

2.1 PCR檢測結果

對采集的豬抗凝血液進行PCR檢測，得到的目的片段與PCV2陽性對照擴增的片段大小一致，約為487 bp（圖1）。在檢測的203份樣品中，有16份樣品PCR檢測陽性。

圖1 PCV2的PCR檢測結果

2.2 同源性分析結果

選擇兩個陽性樣品（PCV2-2和PCV2-3）進行測序，使用DNASTAR軟件對序列進行分析，結果顯示PCV2-2和PCV2-3之間的同源性為100%，它們與3個PCV2a參照序列之間的同源性為86.4%～87.4%，與3個PCV2b參照序列之間的同源性為92.9%～96.4%。

圖2 PCV2毒株基因遺傳進化分析結果

2.3 PCV2毒株基因遺傳進化分析結果

將試驗中所獲PCV2核酸序列與GenBank參照序列共同構建遺傳進化樹，結果顯示，本研究所獲得的2個序列與PCV2b型參照序列親緣關系較近，同處于一個分支（圖2）。

3 討論與結論

早在2000年，我國就有學者在吉林、河北、北京、河南、山東、天津、江西7個?。ㄊ校┑?0個豬場采集了共計559份血清，通過ELISA檢測方法，檢測了四種類型豬（未斷奶仔豬、斷奶仔豬、后備母豬及經(jīng)產(chǎn)母豬）的PCV2抗體，發(fā)現(xiàn)陽性率為42.9%[4]。根據(jù)相關數(shù)據(jù)進行推測，我國豬場PCV2陽性率約在96%以上，各生產(chǎn)階段有差異。疾病的發(fā)生率與致死率因豬場管理狀況而有很大差異，發(fā)病率通常為4%～30%，致死率為70%～80%[5]，可見PCV2目前仍是造成養(yǎng)豬業(yè)巨大經(jīng)濟損失的病原體之一。本試驗中，豬體本身未見明顯的PCV2發(fā)病癥狀，檢測的PCV2陽性感染率僅為7.9%（16/203），這與其他文獻中提到的PCV2陽性感染率相比，差異較大。提示新疆石河子和北屯地區(qū)生豬PCV2陽性感染率較低，說明該地區(qū)豬群受PCV2侵害程度較輕。這可能是由于檢測方法和取樣的不同造成的，有待進一步分析。

根據(jù)基因組大小不同PCV2可分為2a和2b兩種基因型。在歐洲和北美兩種基因型均已被證實與豬圓環(huán)病毒?。≒CVD）有關。Kathleen等[6]研究表明,2005年美國暴發(fā)的PCVD與2b型有聯(lián)系。盡管大多數(shù)豬群感染和PCV2有關，但有學者認為PCV2的2個不同基因型在臨床表現(xiàn)并不相同，即兩者的毒力不同，普遍認為2b型的致病性要強于2a型[7]。從2003年開始，伴隨著臨床癥狀的加劇，全球豬群中PCV2流行的基因型逐漸由2a變成2b[8]。雖然現(xiàn)在市售的基于PCV2a的疫苗可以提供對PCV2b的交叉保護，但已研制出的基于PCV-2b的新型疫苗可以提供更高的保護力。本研究證實了新疆北疆石河子和北屯兩地主要流行PCV2b型，為今后如何選用疫苗防制PCVD提供了理論依據(jù)。

[1] 許立華,蘆銀華,王玲,等.豬圓環(huán)病毒研究進展[J].中國病毒學,2004,19(3):288-290.

[2] 曹正.江蘇省規(guī)模化豬場PCV-2流行病學調查與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥的防治[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學,2009.

[3] 王東方.豬圓環(huán)病毒PCR診斷方法建立及標準制定[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學,2008.

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S851.31+3

B

1673-4645(2014)03-0032-03

2013-09-06

新疆石河子市農(nóng)業(yè)科技攻關項目（2013NY04）

施研進（1988-），女，河南汝南人，碩士研究生，主要從事動物傳染病診斷與防治研究

*通訊作者：屈勇剛（1971-），男，陜西渭南人，副教授，碩士生導師，主要從事動物傳染病快速診斷及防治技術研究，E-mail:quyonggang@shzu.ed u.cn