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    NDV7793促進(jìn)人CD4+T細(xì)胞表達(dá)TRAIL的實驗研究

    2014-04-24 02:22:58樊曉暉等

    樊曉暉等

    【摘要】 目的:研究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)弱毒株NDV7793能否促進(jìn)人CD4+ T細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡因子誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)。方法:首先用免疫磁珠分選法(magnetic activated cell sorting, MACS)分選外周血靜止CD4+ T細(xì)胞,然后加抗CD3抗體、抗CD28抗體和白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)使之成為能被NDV激活的CD4+ T細(xì)胞。用流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry,F(xiàn)CM)檢測NDV刺激的CD4+ T細(xì)胞的TRAIL的表達(dá)水平。結(jié)果:MACS法分選外周血得到的CD4+ T細(xì)胞純度達(dá)到(97.38±0.28)%;能被NDV激活的CD4+ T細(xì)胞表面分子CD25和CD69雙陽性表達(dá)率可達(dá)(29.30±1.08)%,與PBS陰性對照組(2.40±1.30)%相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);FCM檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,NDV7793刺激的CD4+ T細(xì)胞TRAIL表達(dá)水平均有顯著升高,且在NDV7793效價為25 HU時達(dá)到最大值。結(jié)論:NDV7793可刺激CD3抗體、CD28抗體和IL-2預(yù)先活化的CD4+ T細(xì)胞表達(dá)TRAIL。

    【關(guān)鍵詞】 新城疫病毒; CD4+ T細(xì)胞; TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體

    NDV是經(jīng)過臨床評估后可以作為載體用于溶瘤治療、基因治療和免疫激活的五種病毒之一[1-3]。全身治療時,只有少部分NDV能到達(dá)腫瘤組織,其發(fā)揮直接的溶瘤作用十分有限[4]。然而NDV在抗腫瘤中卻仍能發(fā)揮重要作用,這與NDV刺激免疫細(xì)胞而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)有關(guān),這些細(xì)胞包括NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及T細(xì)胞等[5-8]。已有實驗證明,NDV可刺激NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)TRAIL的產(chǎn)生而殺傷腫瘤[5-6]。那么CD4+ T細(xì)胞是否能在NDV的刺激后上調(diào)TRAIL的表達(dá)呢?這方面的研究還未見報道。本研究選用來自江西鄱陽湖野鴨的非溶瘤株NDV7793,探討NDV7793激活人CD4+ T細(xì)胞與TRAIL的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 材料 新城疫病毒W(wǎng)DKX/7793/2004(簡稱NDV7793)分離自江西鄱陽湖的野鴨,由香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系管軼教授饋贈;細(xì)胞與雞胚CD4+ T細(xì)胞分離自健康人群的外周血(得到捐獻(xiàn)者知情同意)。9~10 d SPF雞胚,購自南寧市良鳳江農(nóng)牧有限公司;淋巴細(xì)胞分離液購自挪威AXIS-SHIELD公司;CD4+ T細(xì)胞分選試劑盒(130-091-155)購自Miltenyi公司;PE標(biāo)記的鼠抗人CD25(anti-CD25-PE)單克隆抗體、FITC標(biāo)記的鼠抗人CD69(anti-CD69-FITC)單克隆抗體、PE標(biāo)記的鼠抗人TRAIL(anti-TRAIL-PE)單克隆抗體、PE標(biāo)記的Mouse IgG1 κ同型對照、FITC標(biāo)記的Mouse IgG1 κ同型對照、鼠抗人CD3(anti-CD3)單克隆抗體、鼠抗人CD28(anti-CD28)單克隆抗體均購自eBioscience公司;FITC標(biāo)記的鼠抗人CD4(anti-CD4-FITC)單克隆抗體購自BD公司;重組人IL-2、重組人IFNα均購自PEPROTECH公司;RNeasy Mini總RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司;流式細(xì)胞儀(BDFACSCalibur)為美國BD公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 NDV7793的擴增與純化 取0.2 mL血凝效價為51.2 HU(hemagglutinationuint,血凝單位)的NDV7793接種于9~10日齡的SPF雞胚中。擴增培養(yǎng)48 h后,收取血凝效價≥1:1024的尿囊液,置4 ℃?zhèn)溆谩? ℃離心(1000×g,30 min)初步純化,取上清液于4 ℃超速離心(50000×g,1 h),去上清。用含0.1%EDTA的PBS溶解病毒沉淀,得NDV7793病毒原液,效價51200 HU。將病毒原液用含0.1%EDTA的PBS 10倍稀釋成5120 HU的病毒工作液,置-80 ℃保存,備用。

    1.2.2 CD4+ T細(xì)胞的分離純化及鑒定 抽取健康志愿者的靜脈血,用肝素鈉抗凝,與生理鹽水等體積稀釋后采用Ficoll密度梯度離心法離心(800×g,離心20 min),以獲取外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),之后用生理鹽水充分洗滌所得PBMC并計數(shù)。采用免疫磁珠分選法(陰選法)從PBMC懸液中分選收集CD4+ T細(xì)胞。所得CD4+ T細(xì)胞在2 h內(nèi)以anti-CD4-FITC抗體染色,同時設(shè)立IgG同型對照組和空白對照組,經(jīng)FCM鑒定后,以CD4+ T細(xì)胞的比例為90%~99%作為合格純度。

    1.2.3 CD4+ T細(xì)胞的預(yù)先活化及活化水平的檢測 取無菌96孔平底板,每孔加入50 μL(10 μg/mL)的anti-CD3抗體進(jìn)行包被,4 ℃孵育過夜,棄去anti-CD3包被液,用200 μL PBS洗滌兩次,每孔加入2×105個CD4+ T細(xì)胞,再依次加入anti-CD28和IL-2(終濃度分別為2 μg/mL和200 U/mL),作用16 h后,將5×105個anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化后的CD4+ T細(xì)胞重懸于PBS中,加入anti-CD69-FITC和anti-CD25-PE抗體進(jìn)行染色,2 h內(nèi)采用FCM法檢測CD4+ T細(xì)胞的活化水平。

    1.2.4 FCM檢測不同效價NDV7793刺激anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化的CD4+ T細(xì)胞16h后對TRAIL蛋白表達(dá)的影響 采用效價分別為25、50、100、200 HU的NDV7793刺激活化的CD4+ T細(xì)胞16 h。設(shè)立四組對照組:陰性對照組(PBS)、IFNα陽性對照組(IFNα,200 U/mL)、25 HU經(jīng)紫外線滅活的NDV7793(ultra-violet inactivated NDV7793,UV-NDV7793 )刺激組和25 HU NDV刺激的未活化的CD4+ T細(xì)胞組。收集各組CD4+ T細(xì)胞,加入5 μL anti-TRAIL-PE抗體染色(同時設(shè)立IgG同型對照組和空白對照組),4 ℃孵育30 min,加入PBS,200×g離心10 min,洗滌細(xì)胞兩次,加入300 μL PBS重懸細(xì)胞,F(xiàn)CM檢測CD4+ T細(xì)胞表面TRAIL蛋白的表達(dá)情況。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,計量數(shù)據(jù)以(x±s)表示,進(jìn)行隨機區(qū)組設(shè)計方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 CD4+ T細(xì)胞純度的鑒定 FCM法檢測結(jié)果顯示,經(jīng)過免疫磁珠分選法分選出的CD4+ T細(xì)胞的純度達(dá)到(97.38±0.28)%。

    2.2 anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化CD4+ T細(xì)胞的結(jié)果 CD4+ T細(xì)胞經(jīng)anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化后,F(xiàn)CM檢測CD4+ T細(xì)胞的活化程度,即CD25和CD69在CD4+ T細(xì)胞膜上表達(dá)率。結(jié)果如圖1所示,活化的CD4+ T細(xì)胞的CD25和CD69的雙陽性表達(dá)率可達(dá)(29.30±1.08)%,遠(yuǎn)高于PBS陰性對照組的(2.40±1.30)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖1。

    2.3 NDV7793刺激anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化后的CD4+ T細(xì)胞后對CD4+ T細(xì)胞中TRAIL蛋白表達(dá)水平的影響 采用不同效價的NDV7793刺激anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化的CD4+ T細(xì)胞16 h后,F(xiàn)CM檢測TRAIL蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示不同效價NDV(25、50、100 HU和200 HU)刺激后的TRAIL蛋白的表達(dá)量分別為(26.59±5.79)%、(22.94±3.23)%、(18.76±2.85)%和(19.56±4.51)%,與PBS陰性對照組的(5.82±2.05)%和未活化組(4.28±1.42)%比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。其中25 HU NDV7793刺激組與IFNα陽性對照組(21.36±1.60)%比較,差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。UV-NDV刺激組的TRAIL蛋白表達(dá)率為(14.08±2.62)%,與PBS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。25 HU NDV7793刺激組與UV-NDV刺激組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),同時與100、200 HU NDV7793刺激組比較,差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),從而可知,25 HU NDV7793刺激活化的CD4+ T細(xì)胞TRAIL蛋白表達(dá)量最高(圖2)。

    3 討論

    T細(xì)胞是人體重要的免疫細(xì)胞之一。根據(jù)其表面的白細(xì)胞分化抗原的不同,又可以分為CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞等亞群。根據(jù)T淋巴細(xì)胞的功能可將其分為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cell,CTL)、輔助性T細(xì)胞(helper T cell)、調(diào)節(jié)/抑制T細(xì)胞(regulatory/suppressor T cell)和記憶T細(xì)胞(memory T cell)。長期以來,在抗腫瘤細(xì)胞免疫中,人們一直把重點放在CD8+ T CTL上,而忽視了CD4+ T CTL和CD4+ Th細(xì)胞的作用。已有研究表明活化的CD4+ CTL細(xì)胞可直接殺傷腫瘤細(xì)胞[9],然而NDV通過對CD4+ T細(xì)胞的免疫刺激進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的研究較少報道,因此,筆者選擇用NDV7793弱毒株刺激CD4+ T細(xì)胞,探討CD4+ T細(xì)胞活化的初步機制,為后續(xù)研究NDV7793活化CD4+ T細(xì)胞對癌細(xì)胞的殺傷及機制研究奠定基礎(chǔ)。

    關(guān)于活化CD4+ T細(xì)胞的表型,筆者選擇了TRAIL。TRAIL是繼TNF、FasL之后發(fā)現(xiàn)的第3個TNF家族的凋亡因子,在大多數(shù)的正常組織細(xì)胞都有顯著表達(dá),但并不殺傷大多數(shù)的正常細(xì)胞,其首要的作用是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。在腫瘤生物治療中,TRAIL作為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成員之一,已經(jīng)成非常有潛力的腫瘤生物治療因子之一[10-11]。

    實驗中筆者用流式細(xì)胞術(shù)(FMC)檢測到了受NDV7793刺激的活化的CD4+ T細(xì)胞顯著表達(dá)了TRAIL蛋白,與IFNα陽性對照組及PBS為陰性對照組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),證實了NDV7793可以上調(diào)活化的CD4+ T細(xì)胞TRAIL的表達(dá)。NDV7793在刺激未活化的CD4+ T時,TRAIL蛋白并沒有得到顯著表達(dá),在此筆者推測NDV7793不能激活CD4+ T細(xì)胞,并且只能通過活化后的CD4+ T發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。另外,被滅活的NDV7793(UV-NDV)在刺激活化的CD4+ T時,TRAIL蛋白的表達(dá)高于PBS陰性對照組,卻低于IFNα陽性對照組和未被滅活的NDV7793組(圖2),說明TRAIL的上調(diào)過程可能存在多個途徑,需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

    在NDV刺激CD4+ T細(xì)胞分泌TRAIL蛋白的實驗中,筆者還發(fā)現(xiàn),NDV刺激CD4+ T細(xì)胞分泌TRAIL,隨著NDV效價的增高到一定的濃度(25 HU),CD4+ T細(xì)胞分泌TRAIL反而下降(圖2),可能的原因是25 HU的NDV是刺激CD4+ T細(xì)胞表達(dá)TRAIL的合適濃度,當(dāng)提高NDV濃度后,過多的NDV將通過抑制CD4+ T細(xì)胞表達(dá)TRAIL過程的某個機制而下調(diào)TRAIL的表達(dá),NDV與CD4+ T細(xì)胞表達(dá)TRAIL這種負(fù)相關(guān)的詳細(xì)機制,值得去深入探討。

    綜上,筆者證實了NDV7793刺激活化的CD4+ T細(xì)胞后,上調(diào)了TRAIL蛋白的表達(dá),為進(jìn)一步完善NDV通過TRAIL發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的免疫機制奠定基礎(chǔ),也為NDV應(yīng)用于抗腫瘤的免疫治療提供一些基礎(chǔ)研究的實驗線索。

    參考文獻(xiàn)

    [1] Aghi M,Martuza R L.Oncolytic viral therapies - the clinical experience[J].Oncogene,2005,24(52):7802-7816.

    [2] Chlichlia K,Schirrmacher V,Sandaltzopoulos R.Cancer immunotherapy: battling tumors with gene vaccines[J].Current Medicinal Chemistry Anti-IFNlammatory and Anti-allergy Agents, 2005,4(4):353-356.

    [3] Schirrmacher V.T cell-mediated immunotherapy of metastases: state of the art in 2005[J].Expert Opin Biol Ther,2005,5(8):1051-1068.

    [4] Schirrmacher V,Griesbach A,Ahlert T.Antitumor effects of newcastle disease virus in vivo: local versus systemic effects[J].Int J Oncol,2001,18(5):945-952.

    [5]殷君,王立芳,樊曉暉,等.新城疫病毒對人NK細(xì)胞表達(dá)TRAIL的促進(jìn)作用[J].腫瘤,2012,32(12):974-981.

    [6] Wilden H,Schirrmacher V,F(xiàn)ournier P.Important role of interferon regulatory factor (IRF) -3 in the interferon response of mouse macrophages upon IFNection by Newcastle disease virus[J].Int J Oncol,2011,39(2):493-504.

    [7] Fournier P,Arnold A,Schirrmacher V.Polarization of human monocyte-derived dendritic cells to DC1 by in vitro stimulation with Newcastle Disease Virus[J].J Buon,2009,14(1):11-22.

    [8] Fournier P,Schirrmacher V.Bispecific antibodies and trispecific immunocytokines for targeting the immune system against cancer: preparing for the future[J].Bio Drugs,2013,27(1):35-53.

    [9] Brown D M.Cytolytic CD4 cells: direct mediators in infectious disease and malignancy[J].Cell Immunol,2010,262(2):89-95.

    [10] Ashkenazi A,Pai R C,F(xiàn)ong S,et al.Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand[J].The Journal of clinical investigation,1999,104(2):155-162.

    [11]郝景波,王文飛,吳云舟,等.重組新城疫病毒Anhinga株與TRAIL蛋白協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞[J].中國生物化學(xué)分子生物學(xué)報,2011,27(1):32-39.

    (收稿日期:2014-02-19) (本文編輯:蔡元元)

    [3] Schirrmacher V.T cell-mediated immunotherapy of metastases: state of the art in 2005[J].Expert Opin Biol Ther,2005,5(8):1051-1068.

    [4] Schirrmacher V,Griesbach A,Ahlert T.Antitumor effects of newcastle disease virus in vivo: local versus systemic effects[J].Int J Oncol,2001,18(5):945-952.

    [5]殷君,王立芳,樊曉暉,等.新城疫病毒對人NK細(xì)胞表達(dá)TRAIL的促進(jìn)作用[J].腫瘤,2012,32(12):974-981.

    [6] Wilden H,Schirrmacher V,F(xiàn)ournier P.Important role of interferon regulatory factor (IRF) -3 in the interferon response of mouse macrophages upon IFNection by Newcastle disease virus[J].Int J Oncol,2011,39(2):493-504.

    [7] Fournier P,Arnold A,Schirrmacher V.Polarization of human monocyte-derived dendritic cells to DC1 by in vitro stimulation with Newcastle Disease Virus[J].J Buon,2009,14(1):11-22.

    [8] Fournier P,Schirrmacher V.Bispecific antibodies and trispecific immunocytokines for targeting the immune system against cancer: preparing for the future[J].Bio Drugs,2013,27(1):35-53.

    [9] Brown D M.Cytolytic CD4 cells: direct mediators in infectious disease and malignancy[J].Cell Immunol,2010,262(2):89-95.

    [10] Ashkenazi A,Pai R C,F(xiàn)ong S,et al.Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand[J].The Journal of clinical investigation,1999,104(2):155-162.

    [11]郝景波,王文飛,吳云舟,等.重組新城疫病毒Anhinga株與TRAIL蛋白協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞[J].中國生物化學(xué)分子生物學(xué)報,2011,27(1):32-39.

    (收稿日期:2014-02-19) (本文編輯:蔡元元)

    [3] Schirrmacher V.T cell-mediated immunotherapy of metastases: state of the art in 2005[J].Expert Opin Biol Ther,2005,5(8):1051-1068.

    [4] Schirrmacher V,Griesbach A,Ahlert T.Antitumor effects of newcastle disease virus in vivo: local versus systemic effects[J].Int J Oncol,2001,18(5):945-952.

    [5]殷君,王立芳,樊曉暉,等.新城疫病毒對人NK細(xì)胞表達(dá)TRAIL的促進(jìn)作用[J].腫瘤,2012,32(12):974-981.

    [6] Wilden H,Schirrmacher V,F(xiàn)ournier P.Important role of interferon regulatory factor (IRF) -3 in the interferon response of mouse macrophages upon IFNection by Newcastle disease virus[J].Int J Oncol,2011,39(2):493-504.

    [7] Fournier P,Arnold A,Schirrmacher V.Polarization of human monocyte-derived dendritic cells to DC1 by in vitro stimulation with Newcastle Disease Virus[J].J Buon,2009,14(1):11-22.

    [8] Fournier P,Schirrmacher V.Bispecific antibodies and trispecific immunocytokines for targeting the immune system against cancer: preparing for the future[J].Bio Drugs,2013,27(1):35-53.

    [9] Brown D M.Cytolytic CD4 cells: direct mediators in infectious disease and malignancy[J].Cell Immunol,2010,262(2):89-95.

    [10] Ashkenazi A,Pai R C,F(xiàn)ong S,et al.Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand[J].The Journal of clinical investigation,1999,104(2):155-162.

    [11]郝景波,王文飛,吳云舟,等.重組新城疫病毒Anhinga株與TRAIL蛋白協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞[J].中國生物化學(xué)分子生物學(xué)報,2011,27(1):32-39.

    (收稿日期:2014-02-19) (本文編輯:蔡元元)

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