Lgr5-Wnt/β-catenin信號通路與胃癌干細胞的研究進展

牛 磊，郗洪慶，陳 凜

解放軍總醫(yī)院 普通外科，北京 100853

綜 述

Lgr5-Wnt/β-catenin信號通路與胃癌干細胞的研究進展

牛 磊，郗洪慶，陳 凜

解放軍總醫(yī)院 普通外科，北京 100853

隨著基礎研究領域的不斷拓展和深入，胃癌的難治性逐漸被歸因于胃癌干細胞的存在和信號通路的異常表達，其中最具代表性的當屬Wnt/β-catenin信號通路。Lgr5作為Wnt/β-catenin通路的受體蛋白亦被認為是眾多惡性腫瘤干細胞潛在的分子標記物。我們將就Lgr5-Wnt/β-catenin信號通路與胃癌干細胞之間的相互關系，結合目前研究進展進行綜述。

胃癌干細胞；Wnt基因; β-連環(huán)蛋白; 富含亮氨酸G蛋白偶聯(lián)受體5

世界范圍內(nèi)，胃癌是第四大常見惡性腫瘤，居全球癌癥死亡率的第二位[1]。由于缺乏可靠的腫瘤標記物無法有效篩查或早期診斷高危人群，同時對中晚期病變治療手段有限，致使胃癌預后較差、復發(fā)率及死亡率高[2]。隨著臨床及基礎研究的不斷深入，目前多數(shù)學者認為治療受限的一個假定解釋是癌干細胞(cancer stem cells，CSC)也稱腫瘤干細胞(tumor stem cells，TSC)的存在。因此，為了達到治愈癌癥的目的，不僅僅要殺死已增殖成熟的腫瘤細胞，更重要的是通過特異性靶向治療消滅腫瘤干細胞[3]。Wnt/ β-catenin通路是最經(jīng)典的一條Wnt信號通路，廣泛存在于多細胞生物體內(nèi)[4]。這條通路主要由各類Wnt信號介導，通過對細胞內(nèi)β連環(huán)蛋白水平的調節(jié)控制目的基因的表達，最終影響腫瘤干細胞的生長、分化和凋亡[5-7]。Barker等[8-9]發(fā)現(xiàn)在腸道隱窩基底部表達Lgr5，而此處被認為是干細胞聚集的位置，因而提出了Lgr5作為腸道腫瘤干細胞標記物的理論。我們將就Lgr5-Wnt/β-catenin信號通路與胃癌干細胞之間的相互關系，結合目前研究進展進行綜述，以期為今后相關研究提供幫助。

1 胃癌干細胞

腫瘤干細胞假說是由Makino[10]于1959年首次提出，認為腫瘤可能由腫瘤干細胞產(chǎn)生。腫瘤干細胞具有自我更新、抗化療藥物及抵抗放射線的特性，所以易導致腫瘤復發(fā)、進展和最終死亡。1997年，Bonnet和Dick[11]從急性粒細胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)患者體內(nèi)分離出帶有CD34+CD38-免疫標記的細胞亞群。盡管這些CD34+CD38-表達陽性的細胞數(shù)量僅占被檢測細胞總數(shù)的0.2%，卻能在非肥胖型糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺損(NOD/ SCID)小鼠體內(nèi)存活并大量分裂增殖，最終引發(fā)急性粒細胞白血病。此后，腫瘤干細胞的相關研究進展迅速，先后在乳腺癌、膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme)、結腸癌、前列腺癌、胰腺癌及肝癌等實體瘤中發(fā)現(xiàn)并分離鑒定了腫瘤干細胞[12-17]。

目前采用兩種方法驗證癌干細胞：一種是體外腫瘤細胞球集落的形成，即在特殊涂層無細胞附著且無血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)只含有表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子的候選干細胞[18]。經(jīng)過規(guī)定培養(yǎng)期后，觀察癌懸浮腫瘤球細胞的形成情況，明確其自我更新能力，這與CSC具有一致性。另一種是在體內(nèi)通過免疫缺陷小鼠的皮下或特定器官(如原位)植入候選干細胞，經(jīng)幾周細胞增殖，可觀察到小鼠成瘤情況，同樣具有自我更新能力[19]。這一方法被認為是證實存在CSC的金標準。同時，大量研究表明，上述兩種方法在評估許多實體候選腫瘤干細胞上都提供了類似的結果。另外，根據(jù)癌干細胞具有抗化療藥物的特性，可通過藥物試驗進行癌干細胞的提純。

2002年，Bjerknes和Cheng[20]首次從小鼠成體胃腺黏膜分離得到胃組織干細胞，生存時間達48周，并擴增出新的腺體。2008年，Takaishi等[21]通過對人胃癌細胞系進行體外克隆形成實驗，得到了球形細胞克隆體；并通過移植腫瘤球細胞到免疫缺陷小鼠皮下，成功建立出成瘤模型，且克隆形成實驗和成瘤實驗具有高度一致性。表明在一些胃癌細胞系中的確存在具有腫瘤干細胞特性的細胞。同時他們又通過熒光激活細胞分選技術和逆轉錄PCR鑒定了胃癌細胞的一些表面標記物分子，在這些分子中CD44分子與體內(nèi)成瘤實驗高度一致，且CD44陽性的細胞具有很好的克隆形成能力和體內(nèi)成瘤能力，而陰性細胞卻不具備這些能力，這些瘤球細胞占陽性細胞的1% ～ 10%。雖然上述研究提示胃癌CSC的存在，CD44可能是胃癌CSC的標記物，但就目前的研究來看，CD44并不是胃癌CSC特異性檢測指標，有必要進一步發(fā)現(xiàn)其他標記物來特異性檢測胃癌CSC。隨著相關研究的不斷開展，有學者綜述了多種胃癌CSC潛在分子標記物(表1)[22]。近來，Chen等[22]從實體胃癌腫瘤及血液中分離培養(yǎng)出胃癌干細胞，并提出應將CD54+CD44+作為胃癌干細胞標記物。Zhang等[23-24]強烈建議CD24+CD44+作為胃癌干細胞分離提取的標記物。他們通過胃癌細胞系及5例胃癌腫瘤組織細胞培養(yǎng)證實上述觀點。但目前，尚無一致認可的一組胃癌干細胞標記物。

2009年，Cao等[25]從人胃癌組織中分離到間充質干細胞樣細胞。這種細胞具有正常間充質干細胞形態(tài)及增殖和分化潛能，由于位于癌細胞周圍，其增殖比正常間充質干細胞快。但不同于胃癌懸浮球細胞的是，在裸鼠體內(nèi)間充質干細胞樣細胞不能形成腫瘤，但這些細胞可以促進血管及細胞外基質的形成，從而促進腫瘤的生長。

2 Wnt/β-catenin信號傳導通路與胃癌干細胞

現(xiàn)在普遍認為干細胞的更新、分化能力受各種信號傳導通路的嚴格調控，一旦信號傳導通路成分表達失調或突變，這種調控機制就會被破壞，進而促使干細胞無限制生長、繁殖，并產(chǎn)生異常分化，形成腫瘤干細胞。同樣，TSC也處在一系列信號傳導通路的調控網(wǎng)絡中。在諸多信號傳導通路中，Wnt信號通路的調控失常是多種類型細胞發(fā)生癌變的主要原因之一。

Wnt是根據(jù)兩種同源基因組合命名的，包括果蠅片段極性基因和鼠原癌基因[26]。人和鼠的基因組織中至少有19個Wnt蛋白家族的成員，在進化上都高度保守。Wnt是一類分泌型糖蛋白，通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用，與細胞膜上的受體結合后可激活3條細胞內(nèi)的信號途徑：Wnt/β-catenin信號途徑、Wnt/Ca2+途徑以及通過Jun氨基端激酶傳導的細胞極性通路。在脊椎動物和無脊椎動物中，Wnt蛋白作為配體刺激受體介導的信號轉導通路。激活的Wnt信號通路可以調節(jié)細胞增殖、存活等生物學行為。Wnt/β-catenin通路是最經(jīng)典的一種Wnt信號通路，它的核心部件在進化中高度保守。在Wnt信號缺失的情況下，胞質內(nèi)β-catenin會被磷酸化及降解。Wnt通過卷曲蛇紋石受體和低密度脂蛋白受體相關蛋白5或6輔助受體可激活胞質中的松散蛋白(dishevelled，Dsh/Dvl)，Dsh能夠將糖原合成酶激酶3β磷酸化，從而阻斷β-連環(huán)蛋白的降解。隨著β-catenin數(shù)量的上升，它進入并積累在細胞核內(nèi)，與特定的轉錄因子相互作用，激活Wnt/β-catenin信號通路靶基因的轉錄，引起細胞遷移能力和細胞極性的改變，從而誘導腫瘤發(fā)生(圖1)[27-28]。

圖 1 Wnt /β-catenin 信號傳導通路示意圖Fig.1 Schematic diagram of Wnt/β -catenin signal transduction pathway

Wnt信號傳導途徑對細胞維持自我更新、抑制分化、增殖、遷徙、極性和凋亡起到重要的作用。β連環(huán)蛋白、腺瘤性結腸息肉病基因、軸素的突變均可導致β-catenin保持穩(wěn)定和異常累積，進入細胞核內(nèi)激活Wnt/β-catenin信號通路靶基因。Barker等[9]研究顯示，Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤細胞對微環(huán)境的適應性也密切相關，Wnt信號在小腸隱窩的生物學方面起著很重要的影響。近年研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路與TSC關系密切，在多種TSC中發(fā)現(xiàn)其上調來介導耐藥及腫瘤的復發(fā)等，如在結腸癌,、前列腺癌、皮膚癌以及慢性髓系白血病等治療中，并且其作用已被證實[29-32]。

表1 胃癌干細胞潛在分子標記物Tab. 1 Potential biomarker of gastric cancer stem cells

目前，已報道的Wnt/β-catenin信號通路在胃癌干細胞的作用相對較少。2012年，蔡琛[33]從人胃癌細胞系MKN-45分離出胃癌干樣細胞，并通過Western blotting檢測出CD44表達量明顯高于普通貼壁細胞，同時平板克隆亞瘤球形成實驗及小鼠成瘤試驗均證實了胃癌干樣細胞的存在。他們檢測到β-catenin蛋白在胃癌干樣細胞中的相對表達量明顯高于貼壁細胞，使用氯化鋰刺激細胞可以活化Wnt/ β-catenin信號通路而增加腫瘤干細胞的自我更新能力。而使用Wnt抑制因子Dickkopf-1(DKK1)阻斷Wnt/β-catenin信號通路后，β-catenin目的基因的信使RNA水平及自我更新能力明顯降低。他們認為，Wnt信號通路是調節(jié)胃癌干細胞自我更新中的重要信號通路，但對非腫瘤干細胞腫瘤細胞沒有明顯的影響。大量的小分子抑制劑或生物抑制因子已被證實其對Wnt信號通路的抑制作用，但是沒有可以有效清除腫瘤干細胞的分子[34]。有必要在下一步的研究中找出多條信號通路中的多個關鍵分子，使其更有效地阻斷調節(jié)腫瘤干細胞自我更新中的關鍵信號通路，從而抑制腫瘤干細胞自我更新，達到清除腫瘤干細胞目的。Mao等[35]認為Wnt1在Wnt/β-catenin通路作用于胃癌干細胞增殖更新中起到了重要作用，同時CD44+Oct4+可作為胃癌干細胞標記物。Kanzawa等[36]則認為Wnt5a在整個過程中起到了關鍵作用。

3 Lgr5-Wnt/β-catenin信號傳導通路

Lgr5，又稱GPR49，是具有18個富含亮氨酸重復序列和7個跨膜區(qū)域組成的大分子蛋白，是G蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一，也是最新發(fā)現(xiàn)的Wnt信號傳導的靶基因[8]。1998年Hsu等[37]首先發(fā)現(xiàn)了該分子并予以命名。最初發(fā)現(xiàn)其與卵泡刺激激素、促黃體生成激素和促甲狀腺激素受體密切相關，并且在肌肉、胎盤、腦和脊髓中表達[38]。2004年，Morita等[39]以新生及成年野生型小鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)Lgr5在新生及成年小鼠的腎上腺、肝、脾中均高表達，成年小鼠中Lgr5有限、稀少地表達分布在胃腸道。2006年，McClanahan等[40]發(fā)現(xiàn)Lgr5在結腸腫瘤中高表達，在39例結腸腫瘤中有25例Lgr5表達上調，占64%；同樣在卵巢癌相關研究中亦發(fā)現(xiàn)了類似的結果。免疫組化染色顯示，這一發(fā)現(xiàn)與受體的mRNA表達相關，下調Lgr5的mRNA水平成功誘導結腸腫瘤細胞的凋亡。他們認為，Lgr5在腫瘤發(fā)生過程中起著潛在作用。2007年，Barker等[9]報道Lgr5在小腸隱窩柱狀細胞中以一種Wnt靶基因的形式進行表達，因為用負顯性TCF4抑制Wnt信號通路后它的表達消失，并且也證明了Lgr5+小腸隱窩柱狀細胞為小腸干細胞，同時在結腸相關研究中也得到了相同結果。Barker等[8-9]在前人研究的基礎上總結認為，Lgr5不僅標識正常腸干細胞，同樣也高表達于維持結腸癌的一些稀少的原始腫瘤細胞或持續(xù)繁殖細胞，即腫瘤干細胞。2010年，Vermeulen等[41]報道Lgr5在結腸癌干細胞內(nèi)表達上調，也證明了大腸癌干細胞以Wnt信號的高水平表達為特征。最近的研究結果顯示，在肝癌、結直腸癌、卵巢癌、基底細胞癌和食管腺癌中Lgr5表達處于高水平，并參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11,40,42-44]。

近期有學者認為，Lgr5是Wnt兼有的受體蛋白，并通過與配體R-spondin蛋白結合介導增強Wnt信號通路[45-46]。Carmon等[47]研究了其作用機制。在配體R-spondin1和Wnt3a的刺激下，Lgr5與Wnt受體LRP6和Fzd5相互作用并形成超復合物，超復合物隨后被內(nèi)化和降解，Lgr5加速了這一過程；發(fā)動蛋白依賴途徑和網(wǎng)格蛋白依賴途徑介導Lgr5的內(nèi)化，抑制內(nèi)吞過程對Lgr5信號沒有影響，敲除C末端的Lgr5分子依舊維持了與LRP6相互作用的能力。然而，相比野生型受體，這種Lgr5分子經(jīng)R-spondin1刺激后顯示出了增強信號通路的能力，并降低了內(nèi)吞率。這一研究直接證明了Lgr5作為Wnt信號復合物在膜水平提高Wnt/ β-catenin信號通路。

Koo等[48]證實E3泛素酶rnf43在Lgr5陽性的小腸隱窩細胞特異性表達，呈現(xiàn)抑制細胞增殖作用，有學者研究發(fā)現(xiàn)，Lgr5參與rnf43/znrf3蛋白的降解，在細胞外存在Rspod1蛋白信號時，Rspod1-Lgr5-rnf43/znrf3形成復合物，促進rnf43/znrf3反轉降解，解除細胞抑制作用，并在Wnt蛋白信號協(xié)同作用下，增強相關通路(圖1)[49]。隨著研究深入，近期已有學者對上述復合物蛋白結構域進行分析，結果提示lgr5以一種媒介方式參與rnf43/znrf3的降解[50-51]。

Lgr5在胃癌和胃癌干細胞方面的研究相對較少。2010年，Barker等調查了Lgr5在胃中的表達情況和評估了Lgr5+VE細胞的干細胞潛在性，結果表明，在幽門腺根部Lgr5標志著多能成體干細胞，單一Lgr5+VE干細胞在體外生成胃癌細胞器，Wnt信號驅動Lgr5+VE干細胞轉化形成胃腺瘤。隨后有許多學者在胃癌組織中發(fā)現(xiàn)了高表達的Lgr5，并與胃癌的增殖、侵襲、轉移相關[52-54]。然而目前胃癌干細胞的分離仍存在一定缺陷，經(jīng)細胞培養(yǎng)增殖并成球實驗后分離出的腫瘤球細胞雖具有干細胞的一些特性，但多為干樣細胞，Lgr5在其生長、增殖及分化中的作用仍不明了。目前多認為其對于腫瘤的自我更新方面起推動作用，Lgr5陽性表達的Ⅰ或Ⅱ期患者有發(fā)展至進展期的趨勢，同時無復發(fā)生存率亦降低[55]。說明Lgr5在胃癌形成及病變進展方面起著重要作用。

總之，在現(xiàn)階段，Lgr5-Wnt/β-catenin信號通路對胃癌及胃癌干細胞惡性生物學行為的影響及其分子調控機制還處于起步階段，相關假設或假說仍未得到充分有力的證實，大部分研究仍停留在Lgr5-Wnt/β-catenin在普通胃癌組織或細胞中的作用，對于其在胃癌干細胞中的實際機制和應用需要進一步探索研究。

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Lgr5-Wnt/β-catenin signal pathway and gastric cancer stem cells

NIU Lei, XI Hong-qing, CHEN Lin
Department of General Surgery, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

CHEN Lin. Email: chenlinbj@sina.com

With the expanded and deepened of basic research fi elds, the refractory of gastric cancer is generally attributed to the existence of gastric cancer stem cells and the abnormal expression of signal pathways, among which Wnt/β-catenin signal pathway is the most representative. As the receptor protein and target gene of Wnt/β-catenin signal, Lgr5 is also considered as the potential biomarker of many malignant tumor stem cells. The relationship between Lgr5-Wnt/β-catenin signal pathway and gastric cancer stem cells is reviewed combining with the current research progress.

gastric cancer stem cells; Wnt gene; β-catenin; leucine -rich - repeat -containing G-protein -coupled receptor 5

R 735.2；Q 291

A

2095-5227(2014)12-1268-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.12.026

時間：2014-09-05 10:08

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140905.1008.001.html

2014-06-03

國家自然科學基金項目(81272698)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81272698)

牛磊，男，在讀博士，醫(yī)師。研究方向：胃癌。Email: lanyushinl@sina.com

陳凜，教授，主任醫(yī)師，博士生導師。Email: chenlinbj@sina.com