乳鼠胰腺間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分裂增殖的抑制作用

張 琪，劉亞千，郝好杰，劉杰杰，陳 華

解放軍總醫(yī)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100853

乳鼠胰腺間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分裂增殖的抑制作用

張 琪，劉亞千，郝好杰，劉杰杰，陳 華

解放軍總醫(yī)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100853

目的 探討乳鼠胰腺間質(zhì)上清液是否對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分裂增殖產(chǎn)生影響。方法取出生4 d乳鼠胰腺組織進(jìn)行組織培養(yǎng)(對(duì)第一代細(xì)胞進(jìn)行干/祖性質(zhì)鑒定，進(jìn)行早期干/祖特性的標(biāo)記OCT4、SOX2免疫熒光染色，之后進(jìn)行胰腺內(nèi)分泌相關(guān)的mRNA水平檢測(cè)Ngn3、PDX1、InsulinⅠ、InsulinⅡ，取上清用于誘導(dǎo))。取6周齡大鼠骨髓進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)培養(yǎng)，并取第二代細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。將上清置于BMSCs中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察BMSCs的形態(tài)和生長(zhǎng)分化情況。結(jié)果乳鼠胰腺中存在SOX2陽(yáng)性干/祖細(xì)胞，并且具有向胰腺方向分化的Ngn3的mRNA表達(dá)，其上清影響B(tài)MSCs生長(zhǎng)分化，但是BMSCs中未出現(xiàn)胰島素因子的表達(dá)。結(jié)論乳鼠胰腺間質(zhì)細(xì)胞可以分泌抑制BMSCs生長(zhǎng)分化的成分。

乳鼠；胰腺；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

糖尿病是以慢性高血糖為特征的代謝性疾病[1]。胰腺是與糖尿病密切相關(guān)的器官，由實(shí)質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞組成，前者包括內(nèi)分泌腺和外分泌腺[2]。當(dāng)胰腺Beta細(xì)胞損傷時(shí)，胰腺內(nèi)、外分泌腺中的干/祖細(xì)胞會(huì)分化為產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞進(jìn)行代償[3-4]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是具有向多個(gè)胚層分化潛能的細(xì)胞，通過(guò)對(duì)糖尿病動(dòng)物的靜脈、腹腔、腎包膜下輸注可以實(shí)現(xiàn)糖尿病的改善和治療[5-7]。而輸注的BMSCs在體內(nèi)環(huán)境下發(fā)揮作用的機(jī)制尚不明確。在本實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)乳鼠胰腺間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)判定胰腺間質(zhì)是否存在定向內(nèi)分泌干/祖細(xì)胞特性的細(xì)胞；通過(guò)其培養(yǎng)上清營(yíng)養(yǎng)BMSCs，探討對(duì)BMSCs分裂增殖的影響，為BMSCs治療糖尿病的作用機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6周齡SD大鼠6只，購(gòu)自北京維通利華公司，于解放軍總醫(yī)院動(dòng)物中心飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后用于BMSCs培養(yǎng)。SPF級(jí)孕17 d SD大鼠購(gòu)買(mǎi)、飼養(yǎng)同前，于生產(chǎn)后4 d取乳鼠胰腺用于胰腺培養(yǎng)。

2 LDMEM培養(yǎng)基配置 1 g LDMEM粉末(Gibco)溶解于1 L去離子水中，配成溶液，過(guò)濾除菌，儲(chǔ)存于高壓滅菌處理的玻璃容器中；取該溶液89 ml，加入10 ml胎牛血清(Gibco)，加入1 ml鏈青霉素(鏈霉素：100 μg/ml；青霉素：100 U/ml)，配成10%血清的LDMEM培養(yǎng)基。

3 胰腺組織培養(yǎng) 出生4 d SD乳鼠置于超凈臺(tái)中，3%硫噴妥鈉麻醉乳鼠，75%乙醇全身消毒3次，之后將乳鼠置于頭高腳低位，左下腹橫切口，取出胰腺置于LDMEM培養(yǎng)基中。將取出的胰腺組織用眼科剪剪至1 mm×1 mm大小，之后將組織分別移入15 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，將組織懸浮于LDMEM培養(yǎng)基中，進(jìn)行接種，接種密度為20 ～ 30個(gè)組織塊/皿(直徑為3.5 cm皿)，補(bǔ)足培養(yǎng)基至3 ml，之后置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后進(jìn)行第一次傳代，又48 h后進(jìn)行第二次傳代，期間每24 h進(jìn)行一次觀察。

4 免疫熒光染色 去除第一代培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，迅速沿培養(yǎng)皿壁加入3 ml 4%的多聚甲醛固定30 min。之后PBS洗3次，每次5 min。3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，PBS洗3次每次5 min。0.5% Triton打孔20 min，PBS洗3次，每次5 min。牛血清室溫封閉30 min，去除封閉液加入胰島素一抗：兔抗大鼠(Sigma，1∶200)。OCT4一抗：小鼠抗大鼠(Abcam，1∶200)。SOX2一抗：山羊抗大鼠(Abcam，1∶200)。一抗4℃過(guò)夜后置于室溫30 min，PBS洗3次，每次10 min。加入二抗488-山羊抗兔(中山金橋，1∶200)，488-兔抗小鼠(中山金橋，1∶200)，594-兔抗山羊(中山金橋，1∶200)，避光，室溫放置1 h。hoechst33342(Sigma，2 μg/ml)避光染色5 min，PBS洗3次，每次10 min，50%甘油封片。熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

5 引物序列 GAPDH：forward primer-CACCCTGT TGCTGTAGCCATATTC，reverse primer-GACATCA AGAAGGTGGTGAAGCAG；InsulinⅠ：forward primer-CCGTCGTGAAGTGGAG，reverse primer-CAGTTGGTAGAGGGAGCAG；InsulinⅡ：forward primer-ATGGCCCTGTGGATC CGCTT，reverse primer-CTAGTTGCAGTAGTTCTCCA；PDX-1：forward primer，GGTGCCAG-AGTTCAGTGCTAA，reverse primer-CCAGTCTCGGTTCCATTCG；Ngn3：forward primer-CT-TCACAAGAAGTCTGAGAACACCAG，reverse primer-CTGCGCATAGCGGACCACAGCTT.

6 RNA提取、PCR和瓊脂糖凝膠電泳 RNA提取：去除第一代培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，加入800 μl Trizol (Invitrogen)，充分裂解5 min后，收集到1.5 ml離心管，加入200 μl氯仿，10 000離心率/min離心10 min，取上清于另一離心管加入等量異丙醇，轉(zhuǎn)速同前，離心7 min，吸去上清，加入1 ml 75%乙醇同轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清再次1 ml 75%乙醇離心5 min，待離心管液體干燥后加入EDTA水20 μl溶解之后備用。cDNA的合成和PCR采用天真公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，方法參照使用說(shuō)明，PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳。

7 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 將6周齡SD大鼠頸椎脫臼處死，取股骨和脛骨置于75%乙醇中消毒3 min。將消毒后的組織于超凈臺(tái)下去肌肉使其僅剩余骨組織，剪刀減去干骺端，用含LDMEM培養(yǎng)基的注射器將骨髓組織沖入培養(yǎng)皿中，反復(fù)輕柔沖洗。將含骨髓沖洗液1 000 r/min離心5 min，棄上清，用LDMEM培養(yǎng)基懸浮，接種于培養(yǎng)皿中。于克隆出現(xiàn)后進(jìn)行傳代，每3 d換液1次，待第一代長(zhǎng)至培養(yǎng)皿面積80%時(shí)，傳至第二代。取第二代培養(yǎng)24 h的BMSCs用于實(shí)驗(yàn)。

8 乳鼠胰腺間質(zhì)細(xì)胞第一代上清誘導(dǎo)BMSCs 實(shí)驗(yàn)組取第一代培養(yǎng)1 d胰腺間質(zhì)細(xì)胞上清10 ml，置于上述BMSCs中，每天觀察BMSCs生長(zhǎng)變化，對(duì)照組為L(zhǎng)DMEM培養(yǎng)基組，待對(duì)照組細(xì)胞面積為培養(yǎng)皿80%時(shí)，取BMSCs細(xì)胞進(jìn)行OCT4、SOX2、Insulin免疫熒光染色。

9 CCK-8檢測(cè)BMSC生長(zhǎng)曲線(xiàn) 培養(yǎng)BMSC至第一代，待細(xì)胞融合至80%后，消化傳代。以每孔1×104細(xì)胞數(shù)接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)基，分別加入200 μl LDMEM培養(yǎng)基(對(duì)照組)和第一代乳鼠胰腺間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)1 d的上清液(實(shí)驗(yàn)組)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0 h、24 h、48 h、72 h分別取8孔，加入10 ml CCK8溶液，37℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0軟件，兩組間比較采用t-test檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 乳鼠胰腺組織細(xì)胞培養(yǎng)可見(jiàn)干/祖特性細(xì)胞培養(yǎng)24 h進(jìn)行倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：LDMEM培養(yǎng)基中胰腺組織周邊可見(jiàn)少量細(xì)胞爬出，最多可達(dá)5層，48 h最大細(xì)胞層數(shù)超過(guò)20層，故進(jìn)行傳代。期間細(xì)胞形態(tài)主要為梭形，此外還有少量為扁圓形(圖1)。細(xì)胞傳至第一代后，24 h內(nèi)生長(zhǎng)迅速，48 h細(xì)胞融合達(dá)80%，細(xì)胞形態(tài)仍為梭形但有變長(zhǎng)趨勢(shì)，扁圓形細(xì)胞比例變少。第一代細(xì)胞進(jìn)行Beta細(xì)胞特異性免疫熒光染色和干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子免疫熒光染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰島素、OCT4染色陰性，SOX2免疫熒光染色陽(yáng)性。由此可見(jiàn)胰腺組織培養(yǎng)的細(xì)胞中具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞(圖2)。

圖 1 原代和第一代乳鼠胰腺間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)(A、B： 50×，C、D： 100×，E、F： 200×)Fig. 1 Cell morphology of neonatal rats of P0 and P1 (A, B： 50×, C, D： 100×, E, F： 200×)

2 乳鼠胰腺間質(zhì)干/祖細(xì)胞具有向胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化的潛能 取第一代乳鼠胰腺間質(zhì)細(xì)胞提取RNA，對(duì)GAPDH、Insulin、PDX1、Ngn3的上下游引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR，瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果發(fā)現(xiàn)InsulinⅠ為陰性， Ngn3、 InsulinⅡ、 PDX1為陽(yáng)性。其中NGn3是胰腺內(nèi)分泌干/祖細(xì)胞的標(biāo)記，由此可見(jiàn)此細(xì)胞具有胰腺內(nèi)分泌干/祖細(xì)胞的特性(圖3)。

3 乳鼠胰腺間質(zhì)上清能抑制BMSCs分裂增殖比較第二代BMSCs細(xì)胞和乳鼠胰腺間質(zhì)細(xì)胞上清培養(yǎng)前后BMSCs生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)：BMSCs上清組較LDMEM培養(yǎng)基組細(xì)胞增長(zhǎng)速度明顯降低，并且失去了BMSCs呈漩渦狀生長(zhǎng)的形態(tài)(圖4，圖5)。培養(yǎng)72 h內(nèi)CCK8增殖實(shí)驗(yàn)顯示，上清組BMSCs增殖明顯減少(圖6)。取共培養(yǎng)3 d的BMSCs進(jìn)行Insulin、SOX2、OCT4免疫熒光染色，未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。

討 論

通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了乳鼠胰腺間質(zhì)中存在著向胰腺內(nèi)分泌方向分化的干/祖細(xì)胞；乳鼠胰腺間質(zhì)培養(yǎng)上清培養(yǎng)BMSCs會(huì)抑制其分裂增殖[8-10]。

圖 2 胰腺間質(zhì)細(xì)胞第一代免疫熒光染色—SOX2(紅)和Hoechst33342(藍(lán))； B： A圖放大Fig. 2 Immunofuorescence staining of pancreatic cells with SOX2 (red) and Hoechst33342 (blue) of passage 1; B: Magnifcation of A

圖 3 第一代乳鼠胰腺間質(zhì)細(xì)胞可見(jiàn)Ngn3的表達(dá)Fig. 3 Ngn3 is positive in the mesenchymal cells of neonatal rats of passage 1

BMSCs移植對(duì)動(dòng)物糖尿病具有改善和治療效果，關(guān)于其治療機(jī)制主要有3種推測(cè)：一是通過(guò)全身治療，MSC最終歸巢到病損局部，之后轉(zhuǎn)分化成待修復(fù)細(xì)胞；二是通過(guò)MSC分泌細(xì)胞因子的作用，這些細(xì)胞因子作用于病損部位，實(shí)現(xiàn)功能的修復(fù)；三是通過(guò)Beta細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫作用[11-14]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到乳鼠胰腺組織培養(yǎng)上清對(duì)BMSCs生長(zhǎng)有抑制作用，表明乳鼠胰腺間質(zhì)細(xì)胞可以分泌一些能夠進(jìn)入到BMSCs內(nèi)的物質(zhì)，影響其分裂增殖信號(hào)傳導(dǎo)。因此我們推測(cè)應(yīng)用BMSCs移植治療糖尿病時(shí)，由于體內(nèi)胰腺局部微環(huán)境的影響，定植到胰腺內(nèi)BMSCs的增殖受到抑制。我們對(duì)乳鼠胰腺組織培養(yǎng)上清孵育3 d的BMSCs檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)胰腺相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，這與Lee等[12]和Ezquer等[13]的觀點(diǎn)一致，即BMSCs發(fā)揮治療作用的機(jī)制不是通過(guò)其轉(zhuǎn)分化實(shí)現(xiàn)的。

圖 4 誘導(dǎo)前實(shí)驗(yàn)組和上清組BMSCs第二代形態(tài)(A、 B：100×， C、D：200×)Fig. 4 Cell morphology of BMSCs of control and supernate group before induction (A, B： 100×，C, D： 200×)

圖 5 誘導(dǎo)3 d后實(shí)驗(yàn)組和上清組BMSCs第二代形態(tài)(A、 B： 100×，C、D：200×)Fig. 5 Cell morphology of BMSCs of control and supernate group after induction for 3 days (A, B：100×，C, D：200×)

圖 6 BMSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)(n=8)Fig. 6 Growth curve of BMSCs (aP＜0.01, vs control)

實(shí)驗(yàn)中第一代乳鼠胰腺間質(zhì)細(xì)胞是具有干/祖特性的快速增殖細(xì)胞，但是其上清卻抑制了BMSCs增殖，這說(shuō)明定向干細(xì)胞和未定向干細(xì)胞所存在的微環(huán)境存在差異，為我們進(jìn)一步研究細(xì)胞之間信號(hào)作用提供了指導(dǎo)，為研究BMSCs的作用機(jī)制提供了方向[15-16]。同時(shí)，第一代乳鼠間質(zhì)細(xì)胞中干/祖特性的細(xì)胞在體外通過(guò)培養(yǎng)而生長(zhǎng)存活，為進(jìn)一步對(duì)于胰腺自身干/祖細(xì)胞的研究提供了基礎(chǔ)。

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Inhibition of supernate derived from neonatal rats in the replication of bone mesenchymal stem cells

ZHANG Qi, LIU Ya-qian, HAO Hao-jie, LIU Jie-jie, CHEN Hua
Institute of Basic Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

CHEN Hua. Email：chenhua_19641027@163.com

ObjectiveTo investigate whether the supernate of neonatal rats can infuence the growth of bone mesenchymal stem cells (BMSCs).MethodsThe infant pancreas mesenchymal cells were cultured to get the supernate, and the stem / progenitor property of passage 1 (P1) was identifed with the early marker of stem/progenitor-OCT4, SOX2 for immunofuorescence (IF) staining and pancreatic endocrine related mRNA -Ngn3, PDX1, Insulin was detected. The 2nd passage of BMSCs derived from the bone of 6-week rats were cultured with the supernate, and the morphology and property about insulin secretion of BMSCs were observed.ResultsThe SOX2 stem/progenitor with positive detection existed in the neonatal rats pancreas and showed the expression of mRNA -ngn3 differentiation to endocrine cells. And the supernate could suppress the growth of BMSCs, with no expression of insulin factor showed in BMSCs.ConclusionPancreatic cells of neonatal rats can secrete some components to infuence the mitosis of BMSCs.

neonatal rats; pancreas; bone mesenchymal stem cells

R 576

A

2095-5227(2014)07-0721-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.07.021

時(shí)間：2014-04-11 17:03

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140411.1703.006.html

2014-03-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30970418)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(30970418)

張琪，女，在讀碩士。研究方向：干細(xì)胞與糖尿病治療。Email：q15321839189@163.com

陳華，男，教授，碩士生導(dǎo)師。Email：chenhua_19641027@163.com