白芷總香豆素、川芎嗪及配伍應(yīng)用對大鼠腦缺血/再灌注損傷的影響*

鐘佩茹，張方亮，何麗娜，劉莎莎，樊耀文，何 新

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193）

·中藥研究·

白芷總香豆素、川芎嗪及配伍應(yīng)用對大鼠腦缺血/再灌注損傷的影響*

鐘佩茹，張方亮，何麗娜，劉莎莎，樊耀文，何 新

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193）

[目的]探討白芷總香豆素、川芎嗪及二者配伍應(yīng)用對大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。[方法]實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、川芎嗪（7．5 mg/kg）組、白芷總香豆素組（50 mg/kg）、川芎嗪-白芷總香豆素（7．5 mg/kg+ 50 mg/kg）組、尼莫地平（10 mg/kg）組。連續(xù)灌胃給藥7 d后，采用線栓法建立大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）腦缺血/再灌注損傷模型。缺血2 h再灌注22 h后進(jìn)行神經(jīng)功能缺失癥狀評分，紅四氮唑（TTC）染色法檢測腦梗死體積，制備腦組織勻漿測定超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）含量。[結(jié)果]與缺血再灌注組相比，川芎嗪、白芷總香豆素及配伍應(yīng)用能明顯改善大鼠受損的神經(jīng)功能障礙（P＜0．05），提高SOD的活力（P＜0．01，P＜0．05，P＜0．01），降低MDA的含量（P＜0．01），川芎嗪-白芷總香豆素組顯著縮小梗死體積（P＜0．05）。[結(jié)論]白芷總香豆素、川芎嗪及配伍使用對大鼠腦缺血/再灌注損傷都有明顯保護(hù)作用，可能與抑制腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)相關(guān)。

白芷總香豆素；川芎嗪；腦缺血/再灌注；脂質(zhì)過氧化；超氧化物歧化酶；丙二醛

腦缺血/再灌注導(dǎo)致腦梗死，屬于中風(fēng)病范疇，具有高致殘率和病死率，是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一。氧自由基的產(chǎn)生增加與腦缺血/再灌注損傷密切相關(guān)，其水平高低決定了腦組織損傷的嚴(yán)重程度。清除氧自由基，減輕腦組織損傷的治療措施，具有重要的臨床意義[1]。

白芷（Radix Angelicaedahuricae）為臨床常用藥物，具有通竅止痛、散風(fēng)除濕等功效，主要以復(fù)方形式出現(xiàn)，其中與川芎的伍用見于多種方藥[2]。白芷香豆素是其主要有效成分，目前研究表明白芷香豆素具有抗炎、鎮(zhèn)痛和解痙等作用[3-4]。川芎嗪作為中藥川芎的有效成分，具有抗腦缺血/再灌注損傷作用[5-6]，臨床主要用于腦血管疾病的治療。因此，本實(shí)驗(yàn)建立大鼠腦缺血/再灌注損傷模型，研究白芷總香豆素以及與川芎嗪配伍應(yīng)用對腦損傷的保護(hù)作用。通過氧自由基水平的改變，探討白芷總香豆素與川芎嗪伍用的藥理學(xué)作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量250～320g，購于天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司，合格證號0004112。

1.2 試劑與藥品 白芷總香豆素提取物（TCE），本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC法檢測，歐前胡素、異歐前胡素以及水合氧化前胡素等總香豆素含量高于52%。鹽酸川芎嗪（TMP，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度高于98%），尼莫地平（Nimodipine，中國藥品生物制品檢定所，批號100270-20002），氯化-2,3,5-三苯基四氮唑（TTC，Sigma公司，批號20130322），BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號20130425），超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20121208），丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20121208）。

1.3 儀器 Flexstation3多功能讀板機(jī)（新加坡Santak公司），ALLEGRA-64R高速離心機(jī)（美國Beckman公司），WH-3微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），AX205十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司），96孔透明板（Corning公司），A5級線栓（北京沙東生物技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 大鼠分組與局灶性腦缺血/再灌注損傷模型的制備

2.1.1 動物分組及給藥 采用隨機(jī)函數(shù)所產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)的方法將大鼠隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組[Sham組，5%羧甲基糖淀粉素鈉（CMA-Na）]，缺血再灌注組[I/R組，5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）]，川芎嗪組（TMP組，7．5 mg/kg TMP），白芷總香豆素組（TCE組，50 mg/kg TCE），川芎嗪-白芷總香豆素配伍組（TMP-TCE組，7．5mg/kgTMP+50mg/kgTCE），尼莫地平組（Nimodipine組，10 mg/kg Nimodipine）。各組大鼠灌胃容積為20 mL/kg。

2.1.2 模型制備 各組大鼠連續(xù)灌胃給藥7 d后，于末次給藥前12 h，禁食自由飲水。并于末次給藥30 min后，以10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉動物，參照Longa[7]等建立的方法制備大鼠線栓法大腦中動脈栓塞（MCAO）模型。假手術(shù)組只分離出血管，不做結(jié)扎以及插線處理。模型制備的具體操作步驟如下：游離右側(cè)頸總動脈（CCA），分離頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA）。于分叉處附近的CCA剪一切口，將長約5 cm，直徑0．235 mm線栓從剪口處插入，沿著ICA走向輕柔推進(jìn)，約進(jìn)入（18．5±0．5）mm，感到阻力即停止，缺血2 h后拔出線栓，結(jié)扎CCA，縫合皮膚，實(shí)現(xiàn)22 h再灌注。于缺血再灌注24 h后，進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評分，以及斷頭取腦組織做指標(biāo)檢測。

2.2 神經(jīng)功能缺損程度評分 參照Berderson[8]評分標(biāo)準(zhǔn)評定大鼠神經(jīng)功能缺損程度，評分在1～3分者為造模成功大鼠，納入實(shí)驗(yàn)，0分和4分者棄去不用。具體評分標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

表1 大鼠神經(jīng)缺損程度評分Tab.1 The standard of neurofunctional scores of rats with cerebral ischemia/reperfusion injury

2.3 TTC染色以及梗死范圍檢測 大鼠麻醉后，生理鹽水進(jìn)行心臟灌流，開顱取腦,去除嗅球、小腦和低位腦干，于-20℃冰箱冷藏10 min，于冰盒中迅速沿冠狀面切成2 mm厚切片，放入1%TTC染色劑中避光37℃孵育15 min，4%甲醛溶液固定1 h，樣本拍照，采用Image-Pro Plus圖片分析軟件，測定腦梗死缺血面積和全腦面積，計(jì)算梗死體積比＝（∑梗死面積×厚度）/（∑全腦片面積×厚度）。

2.4 大鼠腦組織蛋白定量、SOD、MDA測定 大鼠開顱取腦,分離左右腦并分別稱其質(zhì)量，于冰盒中將左腦用生理鹽水（按腦濕質(zhì)量∶生理鹽水=1∶3比例）勻漿，再將腦勻漿稀釋至5%，根據(jù)BCA法測定樣品中蛋白含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書測定樣品SOD活力、MDA含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較時，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnet T3法，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分的比較 假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損，I/R組大鼠具有明顯的神經(jīng)功能缺損，評分為（2．50±0．53）分。與I/R組比較，采用TMP、TCE以及TMP-TCE組預(yù)處理7 d后，顯著改善大鼠神經(jīng)功能缺損程度（P＜0．05）。見表2。

表2 缺血再灌注24 h后各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分（±s）Tab.2 The neurofunctional scores of rats 24 h after cerebral ischemia/reperfusion（±s） 分

表2 缺血再灌注24 h后各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分（±s）Tab.2 The neurofunctional scores of rats 24 h after cerebral ischemia/reperfusion（±s） 分

注：與I/R組比較，＃P＜0．05。

組別Sham組I/R組Nimodipine組TMP組TCE組TMP-TCE組n 10 10 10 10 10 10行為學(xué)得分0 2．50±0．53 1．57±0．84#1．77±0．82#1．71±0．76#1．74±0．67#

3.2 各組大鼠腦梗死范圍的變化 TTC染色結(jié)果顯示缺血再灌注24 h后，I/R組大鼠腦組織損傷嚴(yán)重，腦梗死體積顯著增大（P＜0．01）。TMP、TCE組雖然能夠減小模型大鼠的腦梗死體積，但與I/R組差異無顯著性。而TMP-TCE組與I/R組相比，大鼠腦梗死體積顯著縮小（P＜0．05）。見表3。

表3 缺血再灌注24 h后各組大鼠腦組織梗死體積比的變化（±s）Tab.3 Infarct volume of brains in rats after cerebral ischemia/reperfusion for 24 h（±s）%

表3 缺血再灌注24 h后各組大鼠腦組織梗死體積比的變化（±s）Tab.3 Infarct volume of brains in rats after cerebral ischemia/reperfusion for 24 h（±s）%

注：與Sham組比較，**P＜0．01；與I/R組比較，#P＜0．05。

組別Sham組I/R組Nimodipine組TMP組TCE組TMP-TCE組n 3 3 3 3 3 3梗死體積比0 30．26±3．44** 15．30±2．10#24．50±4．85 19．87±4．13 17．52±1．93#

3.3 各組大鼠腦組織SOD活性的變化 在氧化應(yīng)激反應(yīng)中，SOD具有抗氧化作用，并且能夠?qū)寡踝杂苫鶎?dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。腦缺血2 h再灌注22 h后，I/R組大鼠腦組織中SOD活力與假手術(shù)組相比顯著降低（P＜0．05）。應(yīng)用TMP、TCE和TMPTCE預(yù)處理7 d后，能明顯升高腦缺血/再灌注大鼠腦組織SOD活力（P＜0．01，P＜0．05和P＜0．01）。TMPTCE配伍應(yīng)用使得模型大鼠腦組織中SOD活力均高于TMP組和TCE組。見表4。

表4 缺血再灌注24 h后各組大鼠腦組織SOD活力改變（±s）Tab.4 SOD activities of brain tissue in rats 24 h after cerebral ischemia/reperfusion（±s）U/mg．prot

表4 缺血再灌注24 h后各組大鼠腦組織SOD活力改變（±s）Tab.4 SOD activities of brain tissue in rats 24 h after cerebral ischemia/reperfusion（±s）U/mg．prot

注：與Sham組比較，**P＜0．01；與I/R組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別Sham組I/R組Nimodipine組TMP組TCE組TMP-TCE組n 6 5 6 5 6 5 SOD 429．66±30．69 328．97±38．01** 420．99±61．35##444．56±77．79##405．07±34．22#461．68±42．96##

3.4 各組大鼠腦組織MDA含量的變化 自由基攻擊細(xì)胞中不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致組織損傷。MDA被認(rèn)為是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的生物標(biāo)志物。與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠腦內(nèi)MDA含量顯著升高（P＜0．01）。與I/R組比較,TMP、TCE以及TMP–TCE能夠顯著降低模型大鼠腦內(nèi)MDA含量（P＜0．01），降低幅度分別為59．85%、48．30%和65．75%。見表5。

表5 缺血再灌注24 h后各組大鼠腦組織MDA含量改變（±s）Tab.5 MDA content of brain tissue in rats 24 h after cerebral ischemia/reperfusion（±s）nmol/mg．prot

表5 缺血再灌注24 h后各組大鼠腦組織MDA含量改變（±s）Tab.5 MDA content of brain tissue in rats 24 h after cerebral ischemia/reperfusion（±s）nmol/mg．prot

注：與Sham組比較，**P＜0．01；與I/R組比較，##P＜0．01。

組別Sham組I/R組Nimodipine組TMP組TCE組TMP-TCE組n 6 6 6 6 4 6 MDA 27．39±4．72 49．11±7．15** 31．96±8．90##36．11±1．15##38．62±4．40##34．83±10．24##

4 討論

腦缺血/再灌注損傷是多種機(jī)制參與的復(fù)雜病理生理過程。自由基、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）超載、興奮性氨基酸毒性作用等因素相互影響，調(diào)控腦缺血/再灌注損傷的發(fā)病進(jìn)程[9]。當(dāng)腦缺血缺氧時，腦內(nèi)自由基迅速大量產(chǎn)生，超過體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)清除能力，使得細(xì)胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸過氧化，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷及壞死。并且，大量產(chǎn)生的自由基通過多種途徑細(xì)胞內(nèi)凋亡信號通路，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。SOD是體內(nèi)一種重要的氧自由基清除劑。MDA是自由基所引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物。MDA水平的升高間接地反映生物膜受到自由基的損傷程度。本實(shí)驗(yàn)中，在大鼠腦缺血2 h，再灌注22 h后神經(jīng)功能受到明顯損傷，腦組織中SOD水平顯著減低，MDA含量顯著升高。因此，SOD活力和MDA含量的變化可間接反映自由基在體內(nèi)的生成和體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的功能狀況，與缺血性中風(fēng)的嚴(yán)重程度和預(yù)后恢復(fù)密切相關(guān)[10-11]。

中醫(yī)認(rèn)為缺血性腦卒中為本虛標(biāo)實(shí)、上盛下虛之證，發(fā)病機(jī)理與風(fēng)、火、痰、氣、血密切相關(guān)，產(chǎn)生氣滯血瘀，毒損腦絡(luò)，神機(jī)失用。本病治則主要以活血化瘀，調(diào)理氣血為主。白芷具有較高的的藥用價值，與川芎常配伍應(yīng)用。川芎既能活血又可行氣，為“血中氣藥”，善治血瘀氣滯病證?！侗静萁?jīng)集注》記載“白芷為之使”?？寡ㄐ纬墒侨毖阅X卒中預(yù)防和治療的有效措施。筆者近期研究發(fā)現(xiàn)TMP能夠延長正常小鼠凝血時間且具有劑量依賴關(guān)系，表明TMP具有活血化瘀和抗血栓形成作用。其機(jī)制可能與TMP擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集和改善微循環(huán)相關(guān)[12]。70 mg/kg TCE在小鼠體內(nèi)雖然未體現(xiàn)明顯的抗凝血作用，但是能夠顯著增強(qiáng)TMP的抗凝血活性（待發(fā)表）。因此，TCE協(xié)同增強(qiáng)TMP抗凝血活性，是兩者伍用緩解腦缺血/再灌注損傷，改善缺血性腦卒中預(yù)后的機(jī)制之一。

體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明白芷具有抗炎和抗氧化作用，并且顯示出神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[13]。其中，白芷香豆素類在體外具有確切的抗氧自由基和抗氧化作用[14]。給予大鼠50 mg/kg TCE預(yù)處理7 d后制備腦缺血/再灌注損傷模型。研究發(fā)現(xiàn)，TCE能夠降低腦缺血/再灌注模型大鼠腦梗死體積，明顯改善模型大鼠神經(jīng)功能的損傷程度。對其機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，TCE通過降低組織中MDA含量以及提高SOD活力，發(fā)揮清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化作用，從而達(dá)到對腦缺血的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。TMP具有神經(jīng)保護(hù)作用，降低腦缺血/再灌注大鼠的梗死體積，增加腦組織內(nèi)SOD水平，降低MDA含量，改善模型大鼠的神經(jīng)損傷，能減輕腦缺血/再灌注損傷程度，與報道一致[5]。TMP與TCE配伍應(yīng)用后，能明顯縮小梗死體積，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，減輕自由基所引發(fā)的氧化性損傷，優(yōu)于兩者的單獨(dú)使用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)白芷總香豆素通過清除自由基，減輕過氧化反應(yīng)，改善腦缺血/再灌注損傷，為缺血性腦卒中的治療提供新的治療方法。白芷總香豆素與川芎嗪伍用一方面通過減輕自由基的氧化應(yīng)激損傷；另一方面通過抗血栓形成，改善血流動力學(xué)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。為白芷與川芎臨床配伍用藥提供理論依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，將對白芷總香豆素以及與川芎嗪配伍應(yīng)用的神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。

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Effect of coumarins extract of Angelica dahurica,tetramethylpyrazine and compatible application on cerebral isxhemia/ reperfusion injury in rats

ZHONG Pei-ru,ZHANG Fang-liang,HE Li-na,LIU Sha-sha,Fan Yao-wen,HE Xin
（College of Chinese Materia Medica，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To investigate the individual and compatible effects of coumarins extracts of Angelica dahurica and tetramethylpyrazine(TMP)on cerebral ischemia/reperfusion(I/R)injury in rats．[Methods]Male healthy SD rats were randomly divided into six groups:sham group,I/R group,TMP group (7．5 mg/kg tetramethylpyrazine),TCE group (50 mg/kg total coumarins extract of Angelica dahurica),TMP-TCE group(7．5 mg/kg+50 mg/kg)and Nimodipine group(10 mg/kg)．Rats were pretreated with test drugs for sequential seven days by intragastric administration and underwent focal cerebral ishchemia for 2 h and reperfusion for 22 h．The neurofunctional scores were evaluated and the infarct volume was measured by triphenyltetrazolium chloride (TTC)staining．The activity of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)content in brain were determined to investigate the mechanism．[Results]Compared with I/R group,the neurological deficit in TMP,TCE and TMP-TCE group was significantly improved(P＜0．05),meanwhile the cerebral infarct volume of TMP-TCE group was reduced significantly(P＜0．05)．The activity of SOD was enhanced(P＜0．05 or P＜0．01),and the content of MDA was decreased (P＜0．01)．[Conclusion]Individual and compatible application of the total coumarins extract of Angelica dahurica and tetramethylpyrazine have a protective effect against the ischemic stroke,which might be related with inhibiting the lipid peroxidation of the brain tissue．

total coumarins extract of Angelica dahurica;tetramethylpyrazine;cerebral ischemia/reperfusion;lipid peroxidation; superoxide dismutase;malondialdehyde

R285．5

A

1672-1519（2014）09-0560-04

2014-04-02）

（本文編輯：高 杉，張震之）

10．11656/j．issn．1672-1519．2014．09．15

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（20121210110011）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81373890）。

鐘佩茹（1976-），女，博士，講師，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

何 新，E-mail:hexintn@163．com。