表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測赤蘚紅

李 言，謝云飛，錢 和，姚衛(wèi)蓉

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122)

赤蘚紅，又名櫻桃紅、四碘熒光素、食品色素3號，英文名為Erythrosine，是一種常用的人工合成食品添加劑。我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定［1］，用于調(diào)味醬時(shí)最大使用量0.05g/kg;用于高糖果汁(味)或果汁(味)或果汁(味)飲料、碳酸飲料、配制酒、糖果、糕點(diǎn)上彩裝、青梅最大使用量0.05g/kg;用于紅綠絲、染色櫻桃(系裝飾用)最大用量0.10g/kg。由于過量食用赤蘚紅對人體健康具有潛在的危害性，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織規(guī)定，赤蘚紅的每日允許攝取量為0～1.25mg/kg。食品中赤蘚紅含量的測定標(biāo)準(zhǔn)方法為紙色譜、薄層色譜法和高效液相色譜法［2］，已見文獻(xiàn)報(bào)道的方法包括:分光光譜法［3－4］、示波極譜法［5］、毛細(xì)管電泳法［6］及膠束敏化化學(xué)發(fā)光法［7］等。然而，所有這些方法既耗時(shí)又昂貴，操作復(fù)雜，且不適宜現(xiàn)場監(jiān)測。如今正急需開發(fā)出一種快速簡單的方法來檢測食品中的赤蘚紅。近來，由于擁有高靈敏性和檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)吸引了眾多的目光。自從1970年被發(fā)現(xiàn)以來［8］，表面增強(qiáng)拉曼光譜已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在分子、病原體、細(xì)胞甚至整個(gè)活體動物的研究［9］。用于表面增強(qiáng)拉曼光譜的增強(qiáng)基底包括金納米顆粒［10］、銀納米顆粒［11］、金銀納米粒子［12］、金薄膜［13］、銀薄膜［14］和銀納米棒［15］。金膠因其良好的穩(wěn)定性、易制備和優(yōu)秀的SERS增強(qiáng)效果，被廣泛應(yīng)用在生物化學(xué)和醫(yī)藥方面的表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測。利用表面增強(qiáng)拉曼光譜法測定赤蘚紅尚未曾見文獻(xiàn)報(bào)道。文章研究了赤蘚紅的拉曼光譜，并通過金膠研究了其SERS光譜，同時(shí)用密度泛函理論法對待測物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了計(jì)算并優(yōu)化。文章通過優(yōu)化系統(tǒng)條件(如調(diào)節(jié)pH)建立了SERS檢測方法。文章對快速檢測食品中過量添加的赤蘚紅的可行性進(jìn)行了研究，該技術(shù)對快速、準(zhǔn)確的檢測食品中的赤蘚紅很有價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤蘚紅、氯金酸鉀 Sigma公司，99%;檸檬酸三鈉 上海國藥集團(tuán)，99%;硝酸、鹽酸 北京化工廠，98%;所有水溶液 采用milipore超純水配制。

OptoTrace RamTracer?－200－HS便攜式表面增強(qiáng)拉曼光譜儀 激發(fā)波長785nm，掃描范圍100～3300cm－1，光譜分辨率6cm－1，美國 Silicon Valley公司;Unico UV－4802紫外吸收光譜儀 掃描范圍300～800nm，美國Unico NJ公司。

1.2 赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液

先配制1000μg/mL的赤蘚紅原液，超聲5min。然后從原液依次稀釋100、10、1、0.1μg/mL的不同梯度。

1.3 制備金納米顆粒

本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)還原法制備金納米粒子［16］。所有的玻璃儀器在王水［硝酸/鹽酸(1∶3體積比)］浸泡清洗后使用。具體合成過程如下:將2mL檸檬酸三鈉(1%)溶液快速加入到攪拌條件下煮沸的氯金酸鉀溶液(50mL，0.6mg/mL)中，再繼續(xù)加熱30min，可得紅棕色懸浮液，然后自然冷卻至室溫。制備的金納米粒子的紫外最大吸收峰在556nm。

1.4 拉曼測量

測量范圍為 100～3300cm－1，激光功率為300mW，積分時(shí)間5s。測量純赤蘚紅粉末作為赤蘚紅固體拉曼光譜。

赤蘚紅溶液與金膠以不同體積比混合之后，比較不同的混合時(shí)間，劇烈搖勻，然后加入不同體積比的硝酸溶液以調(diào)節(jié)待測體系的pH。選取最特征的拉曼增強(qiáng)峰用于討論赤蘚紅濃度與信號峰強(qiáng)度之間的關(guān)系。將赤蘚紅濃度逐漸降低，大部分赤蘚紅特征峰仍然可見時(shí)的最低濃度視為赤蘚紅的檢測限。

1.5 理論計(jì)算

本研究采用高斯03軟件包對赤蘚紅分子進(jìn)行構(gòu)型優(yōu)化和光譜計(jì)算。密度泛函計(jì)算時(shí)采用了Becke的三個(gè)參數(shù)混合交換功能(B3)［17］和Lee，Yang and Parr的相關(guān)理論(LYP)［18］，最高基組水平為6－31G(d)，計(jì)算結(jié)果通過Gaussview 5.0(Gaussian，Inc.，PA，USA)查看。

2 結(jié)果與討論

2.1 赤蘚紅理論計(jì)算與實(shí)驗(yàn)拉曼光譜比較

密度泛函理論被廣泛應(yīng)用在分子構(gòu)型優(yōu)化和振動光譜計(jì)算中。圖1所示為赤蘚紅的分子構(gòu)型，同時(shí)比較了理論計(jì)算與實(shí)驗(yàn)拉曼光譜?？梢钥闯?，赤蘚紅理論計(jì)算拉曼光譜與實(shí)驗(yàn)拉曼光譜基本一致。

圖1 赤蘚紅拉曼光譜Fig.1 Raman spectra of erythrosine

2.2 赤蘚紅與金膠不同體積比

待測樣品與金膠的體積比是影響測量信號的重要因素，研究了不同體積比的赤蘚紅與金膠的表面增強(qiáng)拉曼光譜。如圖2所示，當(dāng)赤蘚紅與金膠的體積比為1∶1時(shí)，赤蘚紅的SERS信號在1234、1326、1550cm－1等處信號都相對最強(qiáng)，因此本實(shí)驗(yàn)中均采用這個(gè)比例進(jìn)行研究。

圖2 赤蘚紅與不同比例金膠混合之后的SERS圖Fig.2 SERS spectra of erythrosine with various volumes of Au

2.3 pH對赤蘚紅SERS的影響

為了得到最佳的表面增強(qiáng)拉曼效果，本文測量了不同pH條件下的表面增強(qiáng)拉曼光譜。如圖3所示，用不同濃度的硝酸調(diào)節(jié)赤蘚紅與金膠的pH，當(dāng)混合溶液的pH為5時(shí)，赤蘚紅的SERS信號明顯優(yōu)于其他pH，因此本實(shí)驗(yàn)在pH為5的條件下進(jìn)行研究。改變赤蘚紅與金膠的混合溶液的pH，將會有助于金膠進(jìn)行聚合，產(chǎn)生更多的活性位點(diǎn)，使赤蘚紅分子有效的與金膠進(jìn)行結(jié)合，從而達(dá)到更好的表面增強(qiáng)效果。

2.4 不同混合時(shí)間對SERS的影響

在實(shí)驗(yàn)過程中，隨著混合時(shí)間的變化，赤蘚紅的SERS信號強(qiáng)度會有所增加，因此選擇了幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)研究混合時(shí)間對SERS信號的影響。如圖4所示，1～10min，SERS信號強(qiáng)度有較為明顯的增加;10～15min，SERS信號基本穩(wěn)定，信號強(qiáng)度不再變化。因此選擇將混合溶液放置10min之后再進(jìn)行SERS測量。在10min以前，赤蘚紅可能沒有與金膠完全結(jié)合，所以SERS強(qiáng)度會隨時(shí)間增加而增加;在10min之后，赤蘚紅與金膠基本結(jié)合完全，因此SERS強(qiáng)度不再變化。

圖3 不同pH條件下赤蘚紅的SERS光譜Fig.3 SERS spectra of erythrosine in different pH system

圖4 不同混合時(shí)間赤蘚紅的SERS光譜Fig.4 SERS spectra of erythrosine in different mixing time

2.5 赤蘚紅表面增強(qiáng)拉曼半定量研究

圖5 不同濃度的赤蘚紅SERS光譜Fig.5 SERS spectra of different concentrations of Erythrosine

將赤蘚紅與金膠按照體積比1∶1進(jìn)行混合，然后分別用硝酸將pH調(diào)節(jié)至5，混合均勻之后，10min時(shí)進(jìn)行SERS測量。由圖5可以看出，當(dāng)赤蘚紅的濃度降至1mg/kg時(shí)仍然可以觀察到一部分特征峰，而當(dāng)濃度降低至0.1mg/kg時(shí)，所有的特征峰都已經(jīng)觀察不到，因此本研究中采用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測赤蘚紅的最低濃度為1mg/kg。圖6為赤蘚紅SERS強(qiáng)度隨濃度變化的折線圖?？梢钥闯鼋鹑苣z在較大范圍內(nèi)對赤蘚紅均有較為穩(wěn)定的增強(qiáng)作用。

圖6 赤蘚紅濃度對數(shù)與拉曼強(qiáng)度對數(shù)的關(guān)系Fig.6 Relationship between logarithm of different concentrations and logarithm of SERS intensity of erythrosine

3 結(jié)論

本文采用密度泛函理論(DFT)計(jì)算了赤蘚紅的理論拉曼光譜，確定了赤蘚紅與金膠的體積比1∶1，在pH5的條件下，混合溶液放置10min時(shí)，赤蘚紅的SERS信號最好，檢測限可達(dá)到1ppm，低于食品中的最大允許添加量。該研究為檢測實(shí)際食品樣品中的赤蘚紅提供了研究基礎(chǔ)，但仍需進(jìn)一步的研究將其應(yīng)用到實(shí)際樣品的檢測。

［1］衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所.GB/T5009.35－1996食品中合成色素的測定方法［S］.中華人名共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會，2003.08.11

［2］阮麗萍，吉文亮，劉華良，等.高效液相色譜法同時(shí)測定食品中10種合成著色劑［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2011，23(2): 151－154.

［3］Ozgur M U，Alpdogan G，Koyuncu I.Zero－Crossing derivative spectrophotometric determination of mixtures of sunset yellow and erythrosine in pure form and in tablets［J］.Analytical Letters，2002，35(4):721－732.

［4］Joseph－charles J，Langlois M H，Montagut M，et al. Simultaneous determination of two synthetic dyes Erytrosine and sunset yellow in a pharmaceutical syrup by first derivative visible spectrophotometry［J］.Anal Lett，2000，33(8):1567－1575.

［5］文君，繆紅，范柯.示波極譜法測定食品中人工合成色素赤蘚紅［J］.食品研究與開發(fā)，2001，22(3):63－64.

［6］RyvolovaM，TaborskyP，VrabelP，etal.Sensitive determination of erythrosine and other red food colorants using capillary electrophoresis with laser－ induced fluorescence detection［J］.Journal of Chromatography A，2007，1141(2): 206－211.

［7］劉佩娟，杜建修.膠束敏化化學(xué)發(fā)光法測定赤蘚紅［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2009，28(7):9－11.

［8］Chen L，Choo J.Recent advances in surface－enhanced Raman scattering detection technology for microfluidic chips［J］. Electrophoresis，2008，29:1815－1828.

［9］Park H，Lee S，Chen L，et al.SERS imaging of HER2－overexpressed MCF7 cells using antibody－conjugated gold nanorods［J］.Phys Chem Chem Phys，2009，11:7444－7449.

［10］Lim JK，Kim Y，Kwon O，et al.Adsorptionof 1，3－Benzenedithiol and 1，3－Benzenedimethanethiol on gold surfaces［J］.Chem Phys Chem，2008，9:1781－1787.

［11］Yang KH，Liu YC，Yu CC.Enhancements in intensity and stability of surface－enhanced Raman scattering on optimally electrochemically roughened silver substrates［J］.J Mater Chem，2008，18:4849－4855.

［12］Jing CY，F(xiàn)ang Y.Experimental(SERS)and theoretical (DFT)studies on the adsorption behaviors of L－cysteine on gold/ silver nanoparticles［J］.Chem Phys，2007，332:27－32.

［13］Brolo AG，Addison CJ.Surface－enhanced Raman scattering from oxazine 720 adsorbed on scratched gold films［J］.J Raman Spectrosc，2005，36:629－634.

［14］Aroca RF，Goulet PJG，dos Santos DS，et al.Silver nanowire layer－by－layer films as substrates for surface－enhanced Raman scattering［J］.Anal Chem，2005，77:378－382.

［15］Tao A，Kim F，Hess C，et al.Langmuir－Blodgett silver nanowire monolayers for molecular sensing using surfaceenhanced Raman spectroscopy［J］.Nano Lett，2003，3: 1229－1233.

［16］Peron O，Rinnert E，Lehaitre M，et al.Detection of polycyclic aromatic hydrocarbon(PAH)compounds in arti?cial sea－water using surface－enhanced Raman scattering(SERS)［J］.Talanta，2009，79:199－204.

［17］Becke AD.Density－functional thermochemistry III:The role of exact exchange［J］.J Chem Phys，1993，98(7):5648－5652.

［18］Lee C，Yang W，Parr RG.Development of the Colic－Salvetti correlation－energy formula into a functional of the electron density［J］.Phys Rev B，1988，37:785－789.