抵當(dāng)芪桂湯對(duì)糖尿病大鼠血清TGF-β1及胰島組織超微結(jié)構(gòu)的影響

楊景鋒任艷蕓冷偉趙天才夏米娜

（1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，陜西咸陽(yáng) 712000）

抵當(dāng)芪桂湯對(duì)糖尿病大鼠血清TGF-β1及胰島組織超微結(jié)構(gòu)的影響

楊景鋒1任艷蕓2冷偉1趙天才1夏米娜1

（1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，陜西咸陽(yáng) 712000）

目的：觀察抵當(dāng)芪桂湯對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠血清TGF-β1含量及胰島組織超微結(jié)構(gòu)變化的影響，探討抵當(dāng)芪桂湯防治糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞功能減退的機(jī)理。方法：80只成年雌性SD大鼠隨機(jī)抽取10只為空白組，其余70只大鼠，禁食不禁水12h后予STZ 60mg/kg一次性腹腔注射建模。選取50只成模大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組、中藥常量組、中藥大劑量組、中西藥組，分別給予相應(yīng)藥物干預(yù)。給藥8周末，檢測(cè)各組大鼠血清TGF-β1含量，觀察胰島組織超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：與模型組比較，各給藥組大鼠空腹血糖均明顯降低，中西藥組空腹血糖最低；各給藥組大鼠血清TGF-β1含量均降低，中藥常量組血清TGF-β1含量最低；胰島組織超微結(jié)構(gòu)的改善以西藥組及中藥常量組最為明顯。結(jié)論：抵當(dāng)芪桂湯可能通過(guò)降低糖尿病大鼠血清TGF-β1含量，調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能，防止胰島組織纖維化，從而改善胰島功能狀態(tài)，達(dá)到防治糖尿病的目的。

糖尿病 抵當(dāng)芪桂湯 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 病理學(xué) 實(shí)驗(yàn)研究

糖尿?。―iabetes Me11itus，DM）是由于胰島β細(xì)胞分泌胰島素缺陷及（或）其生物學(xué)作用障礙引起的以高血糖為特征的內(nèi)分泌代謝性疾病。胰島β細(xì)胞功能減退是2型糖尿病主要的發(fā)病機(jī)制之一，故其功能狀態(tài)是反應(yīng)糖尿病發(fā)病及病情變化的一個(gè)重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)高糖的內(nèi)環(huán)境引發(fā)患者體內(nèi)發(fā)生一系列病理生理變化，導(dǎo)致胰島組織慢性纖維化[1]，使胰島β細(xì)胞功能逐漸下降。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察抵當(dāng)芪桂湯對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）含量及胰島組織超微結(jié)構(gòu)變化的影響，探討中藥制劑抵當(dāng)芪桂湯防治糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞功能減退的機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物健康Sprague-Daw1ey大鼠80只，雌性，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（陜）2007-001]提供。

1.2 藥物抵當(dāng)芪桂湯，藥物組成：生黃芪30g、桂枝10g、酒大黃10g、炒白芍15g、鬼箭羽20g、水蛭6g，藥物由陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供并制備煎液。格列齊特：80mg/片，天津華津制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)2E738T。

1.3 試劑與儀器鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ），美國(guó)Sigma公司；TGF-β1 ELISA試劑盒由西安永峰生物試劑有限公司提供；尿糖試紙、羅氏血糖試紙由德國(guó)羅氏診斷有限公司提供；透射電鏡（JEM-2000EXII），日本光學(xué)電子公司出品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組、給藥80只大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選取10只作為空白組，一次性腹腔注射等量檸檬酸緩沖液；其余70只大鼠，禁食不禁水12h后予STZ 60mg/kg一次性腹腔注射，72h后測(cè)其血糖值≥16.9mmo1/L，尿糖（+++）及以上者為造模成功。選取50只成模大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組、中藥常量組、中藥大劑量組和中西藥組，每組10只。空白組、模型組灌胃蒸餾水2mL，西藥組灌胃20mg/（kg·d）格列齊特混懸液2mL，中藥常量組灌胃含生藥量9.48g/（kg·d）的抵當(dāng)芪桂湯濃縮液2mL，中藥大劑量組灌胃含生藥量18.96g/（kg·d）的抵當(dāng)芪桂湯濃縮液2mL，中西藥組灌胃9.48g/（kg·d）抵當(dāng)芪桂湯濃縮液1mL，半小時(shí)后予20mg/（kg·d）格列齊特混懸液1mL。每日1次，連續(xù)8周。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)造模成功后及灌胃第8周末，尾靜脈采血測(cè)血糖值，股靜脈采血，酶聯(lián)免疫法測(cè)血清TGF-β1含量。每組分別選取3只，于胰尾部剪取胰腺組織，分別切片，分別于光鏡及透射電鏡下觀察胰島組織病理結(jié)構(gòu)變化及超微結(jié)構(gòu)的改變。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用（±s）表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有顯著性意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠干預(yù)前后血糖變化與空白組比較，各組造模大鼠血糖均明顯升高（P＜0.05）；干預(yù)8周后，各治療組大鼠空腹血糖均較干預(yù)前下降，且均明顯低于模型組（P＜0.05），以中西藥組為最低。見(jiàn)表1。

3.2 各組大鼠干預(yù)前后血清TGF-β1含量變化與空白組比較，各組造模大鼠血清TGF-β1含量均明顯升高（P＜0.05）。干預(yù)8周后，與模型組比較，各治療組大鼠血清TGF-β1含量均明顯降低（P＜0.05），其中以西藥組降低最為明顯。見(jiàn)表2。

3.3 各組大鼠胰島組織結(jié)構(gòu)的改變光鏡下空白組大鼠胰島組織結(jié)構(gòu)完整，外形飽滿規(guī)則，細(xì)胞界限清楚，胰島細(xì)胞呈團(tuán)索狀分布，細(xì)胞核呈卵圓形，核仁清晰可見(jiàn)，細(xì)胞染色均勻。模型組大鼠胰島萎縮，胞漿明顯減少，胰島β細(xì)胞排列紊亂，空泡明顯，核仁形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞核固縮，甚至缺如。中藥大劑量組表現(xiàn)接近于模型組，胰島萎縮，胰島β細(xì)胞稍紊亂，有空泡形成，可見(jiàn)少數(shù)核固縮。中西藥組胰島組織稍萎縮，胞漿略減少，胰島β細(xì)胞排列略顯紊亂，有大小不等的空泡，少數(shù)細(xì)胞核固縮。西藥組及中藥常量組亦可見(jiàn)中西藥組表現(xiàn)，但胰島β細(xì)胞排列較中西藥組規(guī)則，有少量空泡形成，個(gè)別細(xì)胞核固縮。見(jiàn)圖1。

表1 各組大鼠藥物干預(yù)前后空腹血糖變化情況（±s）mmo1/L

表1 各組大鼠藥物干預(yù)前后空腹血糖變化情況（±s）mmo1/L

注：與同時(shí)期空白組比較，*P＜0.05；與同時(shí)期模型組比較，△P＜0.05；與同時(shí)期中藥常量組比較，#P＞0.05。

干預(yù)前干預(yù)后動(dòng)物數(shù)血糖動(dòng)物數(shù)血糖空白組組別107.17±0.64△7.71±1.0610 1026.34±3.03*830.34±1.81*模型組西藥組1024.30±3.91*1021.33±4.64*△#中藥常量組1025.30±4.77*922.32±4.35*△中藥大劑量組1026.27±3.72*927.46±2.17*△中西藥組1024.06±3.32*820.85±3.14*△#

表2 各組大鼠藥物干預(yù)后血清TGF-β1比較（±s）

表2 各組大鼠藥物干預(yù)后血清TGF-β1比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與中藥常量組比較，#P＞0.05。

組別動(dòng)物數(shù)TGF-β1（pg/mL）空白組1012.27±1.01△模型組819.92±3.16*西藥組1014.96±1.59*△#中藥常量組914.99±1.17*△中藥大劑量組917.36±1.22*△#中西藥組815.33±0.85*△#

圖1 各組大鼠胰島組織病理結(jié)構(gòu)變化（10×40）

3.4 胰島組織超微結(jié)構(gòu)變化電鏡下空白組胰島β細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，核膜光滑，核內(nèi)染色質(zhì)均勻，細(xì)胞內(nèi)有大量分泌顆粒，線粒體無(wú)腫脹，嵴稍紊亂，數(shù)量較多。模型組外分泌部線粒體數(shù)目減少，部分形態(tài)不規(guī)則，有少量空泡，嵴模糊，部分線粒體嵴消失。中藥大劑量組胰島β細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞內(nèi)分泌顆粒模糊不清，線粒體明顯腫大、變形、數(shù)目減少，線粒體嵴模糊不清。中藥常量組外分泌部線粒體稍腫脹，嵴紊亂。西藥組胰島β細(xì)胞體積稍變小，胞核形態(tài)略不規(guī)則，未見(jiàn)固縮，胞內(nèi)可見(jiàn)大量分泌顆粒，線粒體數(shù)目有所減少，線粒體可見(jiàn)少量空泡樣變，未變形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)清晰。中西藥組胰島β細(xì)胞體積稍變小，胞核稍變形，線粒體腫脹、變形、數(shù)目有所減少，線粒體嵴較清晰，部分脂肪滴已溶解，可見(jiàn)中性粒細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠胰島組織超微結(jié)構(gòu)變化（×15000）

4 討論

2型糖尿病患者和模型動(dòng)物普遍存在胰島纖維化現(xiàn)象[2]。胰島纖維化可導(dǎo)致胰島正常的組織結(jié)構(gòu)受到破壞，從而使胰島功能降低，β細(xì)胞數(shù)量減少，分泌胰島素減少。TGF-β1是導(dǎo)致胰島組織纖維化的主要因子之一[3]。研究顯示：（1）高血糖狀態(tài)可導(dǎo)致TGF-β1產(chǎn)生增多[4]，損傷血管，從而使局部TGF-β1水平上調(diào)，激活下游多種信號(hào)途徑，刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[5]，導(dǎo)致胰島纖維化變；（2）高血糖可促進(jìn)胰腺星狀細(xì)胞增殖和活化，胰腺星狀細(xì)胞通過(guò)蛋白激酶C-380有絲分裂原活化蛋白激酶通路，最終導(dǎo)致胰島組織纖維化[6]；（3）糖尿病微血管病變使胰腺局部缺血，導(dǎo)致胰腺纖維化，胰島素分泌減少，糖代謝的紊亂，致脂質(zhì)代謝紊亂，“脂毒性”也是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷的重要因素；（4）“糖毒性”、“脂毒性”作用下，體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的自由基損傷細(xì)胞，通過(guò)脂肪酸的過(guò)氧化反應(yīng)使得細(xì)胞膜完整性破壞，通透性增強(qiáng)，胰島β細(xì)胞逐漸壞死。

中醫(yī)學(xué)雖無(wú)糖尿病病名，但依其癥狀，可歸為“消渴病”范疇。傳統(tǒng)認(rèn)為消渴病的基本病機(jī)為陰虛燥熱。我們經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的臨床觀察，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代2型糖尿病多以氣虛血瘀為基本病機(jī)，并貫穿于病變?nèi)^(guò)程，治當(dāng)以益氣養(yǎng)陰、化瘀通絡(luò)為法。臨床上我們以《傷寒論》抵當(dāng)湯和《金匱要略》黃芪桂枝五物湯化裁組成抵當(dāng)芪桂湯治療本病，取得了較好的療效[7]。該方由生黃芪、炒白芍、桂枝、水蛭、酒大黃、鬼箭羽等組成。方中生黃芪益氣，炒白芍養(yǎng)陰生津，二者合為君藥，共奏益氣養(yǎng)陰生津之效；酒大黃、水蛭化瘀通絡(luò)，桂枝溫通經(jīng)脈，共為臣藥；佐以鬼箭羽活血化瘀，使血行而不滯，有利于瘀血的祛除。諸藥合用補(bǔ)益而不壅滯，活血而不傷正，共奏益氣養(yǎng)陰、化瘀通絡(luò)之功。既往實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)該方對(duì)糖尿病大鼠血清HbA1、cvWF有降低作用，對(duì)糖尿病心肌病變有防治作用[8-9]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：隨著藥物干預(yù)性治療的進(jìn)行，格列齊特在降低血清TGF-β1含量方面優(yōu)于中藥，但在改善胰島組織功能方面與中藥常量組相當(dāng)，在降低血糖方面不及中藥加西藥組。中藥常量組整體療效明顯優(yōu)于中藥大劑量組。其機(jī)制可能為通過(guò)降低血糖，使“糖毒性”、“脂毒性”逐漸緩解，阻斷了血清TGF-β1的表達(dá)，延緩了胰島組織的纖維化進(jìn)程，使胰島β細(xì)胞的功能得到保護(hù)，從而達(dá)到治療效果。單就降糖而言中西藥組療效最佳，可能與中西藥物間的協(xié)同作用有關(guān)。中藥大劑量組療效不及常量組，提示中藥治病也有嚴(yán)格的量效關(guān)系。

綜上所述，中藥制劑抵當(dāng)芪桂湯不僅能降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的空腹血糖，還能通過(guò)影響糖尿病大鼠TGF-β1的表達(dá)，阻止胰島組織進(jìn)一步纖維化變，調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能狀態(tài)，而達(dá)到防治糖尿病的目的。

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R587.105

A

1672-397X（2014）05-0077-03

楊景鋒（1970-），男，碩士學(xué)位，教授，主要從事經(jīng)方防治糖尿病及其并發(fā)癥研究。yangjingfeng1970@126. com

2014-01-29

編輯：吳寧

陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目（11JK0675）；陜西省重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目