紫山藥組織培養(yǎng)及褐化因素的研究

王碧琴，朱 祺，劉騰云，李彥強，周 華

(江西省科學院生物資源研究所，江西 南昌330029)

0 前言

紫山藥(Purple yam)，別名薯蕷，屬薯蕷科(Dioscoreaceae)山藥屬(Dioscorea L.)，是一年生或多年生纏繞性藤本植物，能形成肥大的地下肉質(zhì)塊莖供為食用或藥用。我國是山藥重要原產(chǎn)地和馴化中心，紫山藥屬于山藥的紫紅肉品種群，在我國南方的浙江、福建、江西等地有大面積栽培。

紫山藥通常以塊莖切成6～10 cm長帶隱芽表皮的塊莖(約80 g)，可直接栽種或育苗移栽。由于長期的塊莖繁殖和耕地的連作，植株遭受到病毒病侵染，以致種性退化，品質(zhì)下降，產(chǎn)量降低，感病株率上升。隨著農(nóng)藥化肥的大量施用，病毒病不但得不到控制，而且更加嚴重至蔓延，危及到整個產(chǎn)業(yè)以致某些優(yōu)良品種瀕臨滅絕。

紫山藥通過莖尖脫毒培養(yǎng)不但能去除植株體內(nèi)的病毒或減少病毒，而且能使優(yōu)良品種種性得以保存延續(xù)［1，2］。但山藥在組織培養(yǎng)過程中存在著嚴重的褐化發(fā)應(yīng)，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)山藥組培苗或外植體枯死及其基部培養(yǎng)基顏色黑褐化，這種褐化現(xiàn)象又稱為酚污染，嚴重影響外植體的脫分化和培養(yǎng)物的再分化［3］。到目前為止，山藥(紫山藥)組織培養(yǎng)研究僅限于少量的實驗室階段，還末涉及到快繁體系方面的研究。因此，本著紫山藥組織培養(yǎng)快繁體系的建立，生產(chǎn)組培試管苗，盡快轉(zhuǎn)化應(yīng)用田間，筆者就目前紫山藥組織培養(yǎng)過程中的褐化現(xiàn)象及有效控制等方面進行了研究探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫山藥(紫玉紅)嫩莖尖、莖段。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基 初始誘導分化培養(yǎng)基:MS6BA 0.5～2.0 mg/L+NAA 0.1～0.5 mg/L或培養(yǎng)基附加Vc、PVP、AC 0.01～0.2 g/L，以上培養(yǎng)基含45 g/L食用糖，瓊脂6 g/L，pH5.8。

1.2.2 外植體消毒和接種 莖段和莖尖消毒:去掉展開的葉片分別剪成帶葉柄的莖段、莖尖，用洗液清洗.分別用0.1%Hgcl浸泡消毒。莖尖5 min，莖段10 min然后用無菌水沖洗數(shù)次。消毒好的材料備用。

(1)莖尖和莖段的初始培養(yǎng):莖段0.8～1.0 cm，莖尖0.5～0.8 cm分別接種于初始培養(yǎng)基上每處理重復3次，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計成活率(成活率=枯死數(shù)/接種數(shù)×100%)。

(2)激素濃度對莖尖、莖段的誘導分化:莖段0.5 cm，莖尖0.3 cm左右接種在誘導分化培養(yǎng)基上每處理重復2次。40 d后觀察變化，統(tǒng)計誘導分化率及不定芽增殖數(shù)(誘導分化率=萌芽數(shù)/接種數(shù)×100%，不定芽增殖數(shù)=培養(yǎng)物萌發(fā)新的芽體數(shù))。

(3)培養(yǎng)周期對莖尖、莖段誘導分化:莖尖0.3 cm，莖段0.5 cm分別接種在誘導分化培養(yǎng)基上，每處理重復2次，培養(yǎng)20 d為繼代周期，繼代4次并統(tǒng)計不定芽增殖數(shù)。

(4)抗褐化劑Vc、PVP、AC篩選及對莖尖、莖段誘導分化影響:培養(yǎng)一個周期，觀察培養(yǎng)物生長狀況和培養(yǎng)基褐化的程度。比較不同抗氧化的效果及組培苗生長狀況。

以上培養(yǎng)溫度25±2℃，光照1 200 lx，10 h/d。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖、莖段的誘導培養(yǎng)

莖段帶節(jié)間0.8～1.0 cm(72段)，莖尖0.5～0.8 cm(30個)分別接種于初始培養(yǎng)基上培養(yǎng)，2－3 d培養(yǎng)物基部開始變褐，褐色物滲入培養(yǎng)基呈圓形并遂步擴散，10－15 d左右外植體基部褐化加重，部分莖尖變褐整個枯死，莖段基部1/3處枯死。培養(yǎng)20 d統(tǒng)計莖尖平均枯死率在17%，莖段枯死率在7%。外植體培養(yǎng)20 d后基部的莖節(jié)處腫大并有淡紅色圓形芽點;莖段葉柄張開腋芽開始萌動，30 d左右莖段葉腋抽生1～2個不定芽0.5～2.5 cm，稍嫩的莖段葉腋形成0.1～0.2 cm小瘤狀物，初始培養(yǎng)莖尖、莖段的成活率分別是43%和91%。

2.2 6-BA濃度對莖尖、莖段的誘導分化影響

莖尖0.3 cm(12個)、莖段0.5 cm(30段)分別接種在1、2、3、4、5誘導分化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3－5 d莖段切口處分泌褐色物擴散培養(yǎng)基由淺褐致深褐，10－15 d莖段基部增粗葉柄張開，腋芽萌發(fā)單個或多個不定芽小點，單個不定芽伸長生長較快，20 d左右不定芽基部生長1～3條淡紅色不定根，不定根生長伸長較莖快，直接伸入培養(yǎng)基，分泌酚類化合物受多酚氧化酶激活產(chǎn)生醌類物質(zhì)，加重了培養(yǎng)基褐化程度，15－20 d不定根2～4 cm長，不定芽2.0 cm長，隨著激素濃度的加大莖段形成的叢生芽體數(shù)增多，最多可達5～7個不等。莖尖由于個體小分化的芽點也小，雖然分化率高但能形成正常的小芽少，隨著培養(yǎng)時間延長部分小芽可生長成正常芽，但芽體較弱、矮小或畸型。實驗表明6-BA 1.0 mg/L下有利培養(yǎng)不定芽。

2.3 培養(yǎng)周期對莖尖、莖段誘導分化影響

莖尖0.3 cm(30個)莖段0.5 cm(30個)接種誘導分化培養(yǎng)基上，每培養(yǎng)20 d后繼代相同培養(yǎng)基并統(tǒng)計增殖的小芽，莖段培養(yǎng)15－20 d后不定芽由莖段基部葉腋隱芽分化或由腋芽直接分化形成不定芽;此時莖尖僅在葉腋處膨大露出小小的芽點。2次繼代后莖段不定芽0.5～1.0 cm長，40 d不定芽增殖數(shù)達到高峰，增殖數(shù)由(20 d) 23＜(40 d)42＞(60 d)15＞(80 d)11遂步下降，隨著培養(yǎng)時間增加，不定芽增多，形成多個多芽體，莖節(jié)處有少量的不定根，莖段第3次繼代苖高為2.0～4.0 cm，基部1～2節(jié)處有多條不定根，并有多芽體叢生現(xiàn)象。此時基部不定芽的分化基本停止，但莖腋處仍產(chǎn)生重疊多芽體，致使芽體莖桿細小或叢枝狀，不利于作次代增殖材料。不定芽增殖數(shù)隨培養(yǎng)時間延長由少量增多至高峰后到回落，實驗表明，在一定的時間內(nèi)莖尖、莖段培養(yǎng)增殖數(shù)(20 d)0＜(40 d)27＜(60 d)40＞(80 d) 34，培養(yǎng)60 d為不定芽增殖數(shù)最高值。

2.4 Vc、PVP、AC篩選及莖尖、莖段誘導分化影響

紫山藥外植體莖尖、莖段在誘導培養(yǎng)基中添加一定量的抗氧化劑Vc、PVP、AC時所產(chǎn)生的效果差異顯著?？箟难?Vc)對莖尖、莖段外植體培養(yǎng)過程中沒有抑制褐化的效果，但對培養(yǎng)基凝固有負作用。莖尖在PVP、AC培養(yǎng)基培養(yǎng)隨著抗氧化劑量的增加，死亡率增加。這是因為在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物對培養(yǎng)條件有敏感拮抗效應(yīng)，加上外植體接種后由自養(yǎng)變?yōu)楫愷B(yǎng)，細胞代謝發(fā)生變化，產(chǎn)生了一些酚類化合物，這些酚類物質(zhì)受多酚氧化酶激活，被氧化后產(chǎn)生醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)呈粽褐色隨著外植體的傷口或愈傷組織遂步從組織擴散到培養(yǎng)基中，影響了外植體器官的分化，以致幼芽體不能正常的機理代謝而死亡。PVP、AC對莖段培養(yǎng)有抗褐化能力，能抑制褐化物質(zhì)進一步擴散，維持莖段幼芽體正常萌芽生長。這是因為莖段組織具有完備成熟的機理系統(tǒng)，在抗氧化物質(zhì)的作用下對自生系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，對物體基部的褐化－醌類物質(zhì)受到阻隔，在一定的范圍內(nèi)擴散，不影響莖段的正常生長。這種不同的效果與外植體自身的生理結(jié)構(gòu)－植物受體部位內(nèi)源物質(zhì)的含量有密切關(guān)系。

PVP、AC對莖尖、莖段外植體培養(yǎng)過程中有抑制或延遲褐變的效果。

3 小結(jié)

褐變是指植物組織培養(yǎng)過程中，由于外植體組織被切割和接種快繁時，損傷切面細胞中酚類物質(zhì)在酚氧化酶的作用下與氧氣聚合而發(fā)生氧化反應(yīng)，形成有毒的醌類物質(zhì)。外植體切面迅速變成棕褐色或暗褐色，并逐步擴散至培養(yǎng)基中，抑制其它酶的活性，導致組織代謝紊亂，生長受抑制，最終致使外植體死亡［4］。

(1)紫山藥細胞組織含有極高量的酚類物質(zhì)，因此外植體在接種后需多次的更換培養(yǎng)基，減少褐化物的累積，保持培養(yǎng)物的正常生長環(huán)境。

(2)據(jù)資料“6－芐基腺嘌呤和激動素濃度高也有誘導褐化的作用”。培養(yǎng)基中的高激素濃度有加劇外植體褐變的因素，實驗表明，在莖段誘導分化培養(yǎng)基激素濃度越高褐化越重。由此，6-BA激素濃度在1.0 mg/L有利于器官的正常分化。

(3)試驗證明，在一定的范圍內(nèi)激素濃度與莖尖、莖段誘導分化率成正比，激素濃度越高分化的不定芽越多，繼代次數(shù)越多產(chǎn)生不定芽多芽體也多，尤其在不定芽2次繼代后比較明顯，這與晏嬰才的盾葉薯蕷組織培養(yǎng)與快速繁殖研究激素組合對多芽體的影響結(jié)論基本相似。

［1］ 顏昌敬.植物組織培養(yǎng)手冊［M］.上海:上?？茖W技術(shù)出版社，1990.

［2］ 蔡建榮，曾 軍，張志勇，等.懷山藥莖段組織培養(yǎng)及增殖的研究［J］.福建農(nóng)業(yè)科技，2002，(2):14－15.

［3］ Mager AM，Harel.Polyphenol Oxidases in plants［J］.Phytochemistry，1979，18:193－215.

［4］ 蔡建榮.山藥莖段愈傷組織褐變與外源藥物抑制效應(yīng)的研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2008，(5):523－525.