四種方法對不同MCV水平血小板計(jì)數(shù)的影響

鄭玉芬 盧國光 吳春龍 褚邦勇

（浙江省臺(tái)州醫(yī)院，浙江臨海 317000）

·臨床研究·

四種方法對不同MCV水平血小板計(jì)數(shù)的影響

鄭玉芬 盧國光 吳春龍 褚邦勇

（浙江省臺(tái)州醫(yī)院，浙江臨海 317000）

目的探討采用不同的方法進(jìn)行血小板（PLT）計(jì)數(shù)時(shí)分析平均血細(xì)胞比容（MCV）對計(jì)數(shù)結(jié)果產(chǎn)生的影響。方法依據(jù)Sysmex XE－2100血細(xì)胞分析儀測得MCV值將668例標(biāo)本分為MCV＞80fl、≥70～80 fl、≥60～70 fl、＜60 fl，根據(jù)PLT計(jì)數(shù)又分為，PLT≤30×109／L、（31～125）×109／L、（126～350）×109／L和＞350×109／L四組。采用Sysmex XE－2100血細(xì)胞分析儀的光學(xué)法（PLT－O）、電阻抗法（PLT－I）和Coulter LH－750血細(xì)胞分析儀的擬合曲線法以及手工計(jì)數(shù)法對MCV處于不同范圍內(nèi)的668例標(biāo)本進(jìn)行PLT計(jì)數(shù)，并以流式細(xì)胞儀法（FCM）檢測PLT計(jì)數(shù)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，將以上五種方法所得PLT計(jì)數(shù)結(jié)果互相比較，進(jìn)行分析。結(jié)果當(dāng)MCV＞80fl時(shí)，PLT無論低值還是高值，PLT－I、擬合曲線法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果與FCM法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)MCV≥70～80fl時(shí)，低值PLT的PLT－I、擬合曲線法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果與FCM法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而PLT＞30×109／L的各組PLT－I、擬合曲線法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果與FCM法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)MCV≥60～70 fl時(shí)，只有高值的PLT（＞350×109／L）在PLT－I、擬合曲線法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果與FCM法PLT計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），包括低值PLT的其余各組PLT－I、擬合曲線法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果與FCM法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)MCV＜60fl時(shí)，無論高值PLT還是低值PLT，PLT－I、擬合曲線法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果與FCM法PLT計(jì)數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論在使用PLT－I、擬合曲線法做PLT計(jì)數(shù)時(shí)，如MCV＜70fl，PLT計(jì)數(shù)會(huì)增高，而使用PLT－O、手工法做PLT計(jì)數(shù)時(shí)MCV對計(jì)數(shù)結(jié)果無顯著性影響。當(dāng)MCV＜70fl時(shí)且PLT直方圖異常的標(biāo)本應(yīng)采用PLT－O和（或）手工法復(fù)查PLT計(jì)數(shù)結(jié)果；且對于低值PLT（PLT≤30×109／L），當(dāng)MCV≥70～80fl時(shí)PLT計(jì)數(shù)結(jié)果就會(huì)出現(xiàn)假性增高。

平均血細(xì)胞比容；PLT計(jì)數(shù)；光學(xué)法；電阻抗法；擬合曲線法；手工計(jì)數(shù)法

各種血液分析儀對血小板（PLT）的檢測多采用電阻抗原理，雖然在對正常標(biāo)本進(jìn)行檢測時(shí)其PLT計(jì)數(shù)結(jié)果比較可靠，但當(dāng)標(biāo)本有小紅細(xì)胞出現(xiàn)和（或）紅細(xì)胞碎片較多時(shí)，PLT和小紅細(xì)胞及紅細(xì)胞碎片的大小分布出現(xiàn)交疊，對PLT計(jì)數(shù)結(jié)果就會(huì)出現(xiàn)影響，這是受自身檢測原理限制的結(jié)果。本研究以流式細(xì)胞儀PLT計(jì)數(shù)的參考方法為基準(zhǔn)，以手工計(jì)數(shù)及涂片觀察PLT及紅細(xì)胞形態(tài)為輔助手段，著重探討平均血細(xì)胞比容（MCV）處于不同范圍的血標(biāo)本中PLT－I法、PLT－O法及擬合曲線法對PLT檢測結(jié)果的影響。

1 標(biāo) 本

收集本院2013年2～9月門診血常規(guī)668份，其中男320份，女348份。所有血液標(biāo)本采集后室溫（18～22℃）放置，4小時(shí)內(nèi)完成各種PLT計(jì)數(shù)方法對標(biāo)本的平行測定。

2 方 法

2.1 分組 目前已有文獻(xiàn)報(bào)道MCV≥80fl（正常參考值下限）對PLT計(jì)數(shù)無明顯影響，而＜60fl對PLT計(jì)數(shù)影響較大。本研究以10fl為單位逐漸遞減，并根據(jù)Sysmex XE－2100全自動(dòng)血液分析儀所測MCV數(shù)據(jù)分為4組：MCV＜60fl共108例，MCV≥60～70fl共172例，MCV≥70～80fl共184例，MCV＞80fl共204例。每組又依據(jù)Sysmex XE－2100所測的PLT結(jié)果分為增高組：PLT＞350×109／L；正常范圍組：PLT＞（125～350）×109／L；減少組：PLT＞（30～125）×109／L；嚴(yán)重出血組：PLT＜30×109／L。

2.2 儀器與試劑 Sysmex公司生產(chǎn)的XE－2100全自動(dòng)血液分析儀和SP－1000i自動(dòng)推片機(jī)（瑞氏－姬姆薩染色法）；貝克曼公司生產(chǎn)的Coulter LH－750血液分析儀以及美國BD流式細(xì)胞儀及其相應(yīng)配套試劑，儀器均用配套校準(zhǔn)品對其進(jìn)行校準(zhǔn)，標(biāo)本測定前做質(zhì)控品，確認(rèn)儀器處于正常工作狀態(tài)，嚴(yán)格遵照儀器操作規(guī)程。Lecia顯微鏡購于南京高清智能有限公司，XB－K－25型血球計(jì)數(shù)板由上海安信光學(xué)儀器制造有限公司生產(chǎn)，EDTA－K2抗凝管由浙江拱東醫(yī)療科技有限公司提供。PLT稀釋液（草酸銨法稀釋液）按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》［1］第3版配制，于4℃冰箱保存［2］。

2.3 檢測方法 （1）儀器檢測法：所有儀器均用配套校準(zhǔn)品對其進(jìn)行校準(zhǔn)，標(biāo)本測定前做質(zhì)控品，確認(rèn)儀器處于正常狀態(tài)，嚴(yán)格遵照儀器操作規(guī)程的要求，分別記錄數(shù)據(jù)，4小時(shí)內(nèi)測定完畢。Sysmex XE－2100全自動(dòng)血液分析儀和Coulter LH－750血液分析儀的PLT計(jì)數(shù)比對檢測誤差＜1／3 CLIA′88。Sysmex XE－2100全自動(dòng)血液分析儀的計(jì)數(shù)和細(xì)胞分類（CBC＋DIFF）通道及網(wǎng)織紅細(xì)胞／PLT－光學(xué)法（RET）通道檢測，記錄PLT－I及PLT－O數(shù)值；Coulter LH－750血液分析儀計(jì)數(shù)和細(xì)胞分類（CBC＋DIFF）模式檢測，記錄PLT值。BD流式細(xì)胞儀采用2002年ICSH／ISLH所推薦的“使用單克隆抗體（CD41／CD61）的流式細(xì)胞術(shù)”，在流式細(xì)胞儀上檢測得出PLT和紅細(xì)胞比值，將比值與參考方法測定的紅細(xì)胞數(shù)計(jì)算后得出準(zhǔn)確的PLT值［3］。（2）手工計(jì)數(shù)法：將668例血常規(guī)標(biāo)本使用Sysmex公司生產(chǎn)的SP－1000i自動(dòng)推片機(jī)（瑞氏－姬姆薩染色法）制血涂片染色（保證良好的涂片及染色效果）顯微鏡油鏡下觀察100個(gè)視野，剔除PLT聚集或形態(tài)異常的標(biāo)本，由2名技術(shù)熟練的主管技師采用雙盲法手工計(jì)數(shù)PLT，取2次計(jì)數(shù)結(jié)果的均值（2次誤差控制在5%以內(nèi)），手工計(jì)數(shù)嚴(yán)格按《全國檢驗(yàn)技術(shù)操作規(guī)程（第3版）》［1］操作。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，將各組儀器各種方法所測得的PLT值，即PLT－I法、PLT－O法、擬合曲線法、手工計(jì)數(shù)法分別與FCM法得出的標(biāo)準(zhǔn)PLT值采用配對t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

3 結(jié) 果

3.1 不同方法的PLT計(jì)數(shù) 表1與表2中除了MCV≥70～80fl樣本中PLT≤30×109／L組PLT－I、擬合曲線法與FCM法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）外，其余各組各方法與FCM法PLT計(jì)數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；表3與表4中除了MCV≥60～70fl樣本中PLT＞350× 109／L組各方法與FCM法結(jié)果之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P＞0.05），其余各組PLT－I法、擬合曲線法與FCM法結(jié)果之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。各不同MCV水平間PLT－O法、手工法與FCM法之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。詳見表l～4。

表1 5種方法對MCV＞80fl樣本PLT檢測結(jié)果分析（×109／L，±s）

表1 5種方法對MCV＞80fl樣本PLT檢測結(jié)果分析（×109／L，±s）

表2 5種方法對MCV≥70～80fl樣本PLT檢測結(jié)果分析（×109／L±s）

表2 5種方法對MCV≥70～80fl樣本PLT檢測結(jié)果分析（×109／L±s）

表3 5種方法對MCV≥60～70fl樣本PLT檢測結(jié)果分析（×109／L，±s）

表3 5種方法對MCV≥60～70fl樣本PLT檢測結(jié)果分析（×109／L，±s）

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表4 5種方法對MCV＜60fl樣本PLT檢測結(jié)果分析（×109／L，±s）

表4 5種方法對MCV＜60fl樣本PLT檢測結(jié)果分析（×109／L，±s）

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3.2 各組不同方法PLT計(jì)數(shù)與FCM法PLT計(jì)數(shù)的配對t檢驗(yàn)結(jié)果。詳見表5。

表5 四種方法與FCM法檢測PLT的配對t 檢驗(yàn)結(jié)果

4 討 論

血細(xì)胞分析儀器法計(jì)數(shù)PLT有著速度快、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，成為日常工作中的首選方法。但現(xiàn)有儀器大多為RBC、PLT在同一個(gè)通道同時(shí)測定，若標(biāo)本中存在小紅細(xì)胞或其碎片、大PLT、聚集的PLT等情況時(shí)就會(huì)干擾儀器法計(jì)數(shù)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)針對不同的MCV，以PLT計(jì)數(shù)參考方法為標(biāo)準(zhǔn)，探討各方法檢測的PLT的準(zhǔn)確性。

PLT電阻抗法是通過細(xì)胞通過微孔時(shí)產(chǎn)生的瞬間電流變化，通過細(xì)胞的大小來識(shí)別細(xì)胞［4］，所以當(dāng)血中出現(xiàn)一些大小近似PLT的小紅細(xì)胞時(shí)，這些小紅細(xì)胞就會(huì)被當(dāng)作PLT加以計(jì)數(shù)，盡管儀器具有浮動(dòng)界標(biāo)（PLT－I）和擬合曲線（Coulter LH－750）的功能［5］，但由于血液中紅細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于PLT數(shù)量，即使有少部分小紅細(xì)胞混入PLT計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，也會(huì)給PLT數(shù)造成很大的影響，從而使PLT計(jì)數(shù)假性增多。

光學(xué)法（PLT－O）是通過Plymethine和Oxazine對PLT核酸熒光染色，采用前向散射光和側(cè)向熒光對PLT內(nèi)部DNA和RNA成分進(jìn)行鑒別計(jì)數(shù)，因此PLT－O在一定程度上改善了電阻抗法原理僅依靠PLT體積測定所帶來的局限性，能有效地鑒別小紅細(xì)胞、紅細(xì)胞碎片和大PLT，從而排除干擾，得到更可靠的PLT結(jié)果［6］。本文結(jié)果顯示4組標(biāo)本中PLT－O法檢測結(jié)果與FCM法及手工法之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

FCM法采用EDTA抗凝全血加特異性熒光單克隆抗體（CD41和CD61）染色PLT，被染色的PLT在流式細(xì)胞儀上根據(jù)熒光強(qiáng)度、側(cè)向角和前向角散射光對數(shù)放大，設(shè)置紅細(xì)胞和PLT門，細(xì)胞獲取率＜3000個(gè)／s，共收集60000個(gè)以上細(xì)胞，1000個(gè)以上PLT，統(tǒng)計(jì)RBC／PLT－R，根據(jù)每微升血中RBC－C和RBC／PLT－R，按公式PLT／μl＝RBC－C／（RBC／PLT－R）就可以算出PLT，精密度達(dá)2%，遠(yuǎn)高于顯微鏡5%的精密度（在計(jì)數(shù)池中只計(jì)數(shù)500個(gè)PLT時(shí)）［7］。此法測PLT可以排除“非PLT顆?！焙腿斯び?jì)數(shù)誤差的干擾，從而更準(zhǔn)確計(jì)數(shù)PLT，因此該檢測方法在2001年被ICSH推薦為PLT計(jì)數(shù)的參考方法。

低值PLT是臨床一個(gè)重要的危急值，與血栓性和出血性疾病息息相關(guān)，其準(zhǔn)確性對于診治起著決定性作用。而由于血液中紅細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于PLT數(shù)量，即使僅有極少量小紅細(xì)胞混入PLT計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，也會(huì)給PLT計(jì)數(shù)數(shù)造成很大的影響，由于低值PLT（≤30×109／L）基數(shù)較低，這種影響又顯得尤為明顯。表5總結(jié)出，當(dāng)MCV＞80fl時(shí)，PLT無論低值還是高值，PLT－I、擬合曲線法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果與FCM法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)MCV≥70～80fl時(shí)，低值PLT的PLT－I、擬合曲線法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果與FCM法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而PLT＞30×109／L的各組PLT－I、擬合曲線法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果與FCM法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)MCV≥60～70 fl時(shí)，只有高值的PLT（＞350×109／L）在PLT－I、擬合曲線法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果與FCM法PLT計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），包括低值PLT的其余各組PLT－I、擬合曲線法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果與FCM法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)MCV＜60fl時(shí)，無論高值PLT還是低值PLT，PLT－I、擬合曲線法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果與FCM法PLT計(jì)數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

實(shí)驗(yàn)中所有的標(biāo)本已通過涂片染色鏡檢的方法將有PLT聚集或形態(tài)異常的標(biāo)本剔除，且手工計(jì)數(shù)時(shí)由2名技術(shù)熟練的主管技師采用雙盲法手工計(jì)數(shù)PLT，取2次計(jì)數(shù)結(jié)果的均值（2次誤差控制在5%以內(nèi)），PLT手工法結(jié)果較接近FCM法計(jì)數(shù)結(jié)果。本文結(jié)果顯示手工法PLT計(jì)數(shù)結(jié)果在4組標(biāo)本中與FCM法之間差異均無顯著性意義（P＞0.05）。

總之，當(dāng)PLT－I法檢測血常規(guī)時(shí)若測得MCV＜70fl和（或）有PLT直方圖異常時(shí)可選擇PLT－O法、FCM法或手工法進(jìn)行復(fù)查；而對于低值PLT（≤30×109／L），應(yīng)該視MCV情況，當(dāng)MCV＜80fl時(shí)就應(yīng)采用PLT－O法、FCM法或手工法進(jìn)行復(fù)查。而在檢驗(yàn)科日常工作中FCM法雖然計(jì)數(shù)可靠，但其仍存在一些不足之處，如儀器價(jià)格高昂，檢測費(fèi)用高，操作復(fù)雜，為了避免在體外活化，血樣需要在45分鐘內(nèi)處理，不能久置，也不能廣泛應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測；而手工法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且存在計(jì)數(shù)者主觀因素、計(jì)數(shù)池沖池分布不均等原因的影響其結(jié)果準(zhǔn)確性、重復(fù)性較差，不適合大量臨床標(biāo)本的復(fù)查。因此，PLT－O法是解決異常血液標(biāo)本檢測PLT數(shù)的一個(gè)準(zhǔn)確而客觀的重要手段，充分發(fā)揮儀器的優(yōu)越性，準(zhǔn)確測量PLT值，為臨床提供可靠的診療依據(jù)具有重要的意義。

［1］葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程．3版，南京：東南大學(xué)出版社，2006：136

［2］International Council for Standardization in Haematology Expert Panel on Cytometry．International Society of Laboratory Hematology Task Force on Platelet Counting．Platelet counting by the RBC／platelet Ratio Method．A refefence Method．Am J Clin Pathol，200l，115：460

［3］Vander Meer W，MacKenzie M A．Dinnissen J W，et al．Pseudoplatelets：A etrospective study of their incidence andinterference with platelet counting．J Clin Pathal，2003，56：772

［4］張蕾，李智，李泳，等．ABBOTT CD－3700全自動(dòng)血液分析儀對低值PLT檢測準(zhǔn)確度探討．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2008，23（6）：563

［5］叢玉?。?dāng)代血液分析技術(shù)與臨床．北京：人民衛(wèi)生出版社，1997．34

［6］Field D，Taube E，Heumann S．Performance evaluation of the im－mature granulocyte parameter on the Sysmex XE－2100 automatedhematology analyzer．Lab Hematol，2006，12（1）：11

［7］Molloy P L．Electrophoretic mobility shift assays．Methods Mol Bi－ol，2000，130：235

*為通訊作者，E－mail：chuby＠enzemed.com