極化液對內(nèi)毒素休克兔腦氧化損傷的影響

李洪瓊，王藝錚，萬勇，2

(川北醫(yī)學(xué)院，1.附屬醫(yī)院麻醉科；2.麻醉系，四川 南充 637000)

內(nèi)毒素休克是嚴(yán)重循環(huán)、細(xì)胞和代謝失調(diào)的膿毒癥，死亡率高達(dá)35%～40%，而腦是早期受累的器官之一。目前，內(nèi)毒素休克尚缺乏有效的治療手段，且因腦損傷，幸存者大多存在認(rèn)知和行為功能異常，減輕腦損傷可改善預(yù)后，降低死亡率[1]。研究[2-3]證實(shí)，內(nèi)毒素休克時內(nèi)毒素、缺血缺氧等因素導(dǎo)致腦組織中過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)、氧自由基(O-)等氧化物大量產(chǎn)生，而腦氧耗高，抗氧化能力弱，早期即可出現(xiàn)腦氧化損傷，進(jìn)一步破壞血腦屏障，加重炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及免疫失衡等，氧化與抗氧化失衡是腦損傷的主要機(jī)制，早期干預(yù)可改善預(yù)后。研究[4-6]證實(shí)，葡萄糖-胰島素-鉀(極化液，GIK)對缺血心肌有保護(hù)作用，可減輕內(nèi)毒素血癥大鼠肝臟、腸道、脾臟損傷，改善內(nèi)毒素休克患者血流動力學(xué)，減輕內(nèi)毒素血癥大鼠腦損傷，其機(jī)制包括清除氧化物、增加抗氧化劑的產(chǎn)生，減輕氧化損傷、減少細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)等，可用于治療腦缺血再灌注、內(nèi)毒素血癥、危重癥等。本研究通過靜脈注射脂多糖建立內(nèi)毒素休克兔模型，觀察GIK對內(nèi)毒素休克兔腦損傷的影響,初步探索其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 普通級健康雄性新西蘭大白兔由川北醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證編碼：SYXK(川)2013-076]，體重2～3 kg，兔齡12～15周；實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，且實(shí)驗(yàn)人員具備動物實(shí)驗(yàn)從業(yè)資格證書。

1.1.2 主要儀器與試劑 監(jiān)護(hù)儀MEC-2000(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，三諾安穩(wěn)血糖儀，分光光度計(jì)(美國分子儀器公司)，脂多糖LPS(Escherichia：coli055：B5，Sigma公司，美國)，氧化指標(biāo)包括H2O2測定試劑盒(比色法A064-1-1)、NO測定試劑盒比色法(A012-1-2)、一氧化氮合成酶(NOS)分型測試盒(比色法，A014-1-2)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法，A003-1-2)和抗氧化指標(biāo)包括總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(WST-1法，A001-3-2)、總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒微板法(A015-2-1)(南京建成生物工程研究所)，兔NSE ELISA試劑盒(上海滬尚生物科技有限公司)，透射電鏡H-600IV(Quantum Design中國子公司)，數(shù)碼三目攝像顯微鏡BA400Digital(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)毒素休克模型建立與動物分組 稱量并記錄體重后經(jīng)左耳緣靜脈注射1%戊巴比妥鈉(3 mL/kg)麻醉，隨后行耳緣靜脈、頸動脈穿刺置管，采用壓力傳感器連接監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測血壓，兩組均1 min內(nèi)經(jīng)耳緣靜脈注射LPS 0.5 mg/kg，共計(jì)2.5 mL/kg，待平均動脈壓(MAP)下降至基礎(chǔ)血壓70%以下且穩(wěn)定5 min以上判定為內(nèi)毒素休克模型建立成功[7]。將建模成功大白兔隨機(jī)分為內(nèi)毒素休克組(ES)和極化液組(GIK)，每組各10只。

1.2.2 給藥及動物處理 ES組和GIK組分別靜脈持續(xù)泵注復(fù)方氯化鈉注射液和極化液GIK(葡萄糖G:200 G/L；胰島素I:60 U/L；氯化鉀K:60 mmol/L)，5 mL·kg-1·h-1，時間6 h。靜脈注射空氣法處死白兔并立即采集腦組織標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)中排除動脈置管過程中失血過多(超過10 mL)及給予LPS后2 h內(nèi)MAP沒有下降至基礎(chǔ)MAP 70%以下(3只)或者快速下降基礎(chǔ)MAP 30%以下甚至實(shí)驗(yàn)過程中死亡的白兔(2只)，共5只，并進(jìn)行相應(yīng)補(bǔ)充，保證每組10只存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)過程中每隔2 h經(jīng)靜脈注射1%戊巴比妥3 mL維持麻醉深度。

1.2.3 平均動脈壓和血糖監(jiān)測 采用邁瑞監(jiān)護(hù)儀和血糖儀監(jiān)測記錄動靜脈操作完成后30 min(0T)、LPS注射后造模完成(T0)、復(fù)蘇后第1小時(T1)、第2小時(T2)、第3小時(T3)、第4小時(T4)、第5小時(T5)、第6小時(T6)的MAP、血糖(G)。

1.2.4 血清NSE濃度檢測 分別于0T、T0、T3、T6采集動脈血2 mL，加2 mL肝素生理鹽水，室溫靜置30 min后，3 500 rpm離心5 min，取上清液分裝，-80 ℃保存。采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測NSE濃度，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 氧化和抗氧化指標(biāo)水平檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即取左腦皮質(zhì)-80℃保存，室溫解凍后取適量皮層腦組織除去血管及腦膜，放置在冰0.9%氯化鈉注射液中漂洗，洗去血液等雜質(zhì)后用濾紙吸干水分并準(zhǔn)確測量0.5 g腦組織，置入預(yù)冷的0.45 mL冰0.9%氯化鈉注射液中作為勻漿介質(zhì)(體積比為1∶9)，用無菌玻璃勻漿管冰水浴條件下手動勻漿數(shù)分鐘，待充分研磨后放置離心管中，用低溫高速離心機(jī)于4℃，3 000 rpm離心10 min，取上清液即為10%腦組織勻漿,將制備好的10%組織勻漿用生理鹽水按1∶4稀釋成2%組織勻漿，嚴(yán)格按照考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒說明書測定并計(jì)算腦組織勻漿中蛋白含量(mgprot/mL)，隨后嚴(yán)格按照試劑盒方法測定勻漿中H2O2、NO、iNOS、MDA、SOD、T-AOC含量。

1.2.6 病理形態(tài)觀察 取1 cm×1 cm×0.2 cm大小右腦皮層組織兩塊放置在4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水機(jī)脫水，透明劑透明，浸蠟后石蠟包埋，蠟塊常規(guī)切片(3～5 μm)后HE染色，具體如下：蘇木精染色10～20 min→自來水沖洗1～3 min→鹽酸酒精分化5～10 s→自來水沖洗1～3 min→放入50 ℃的溫水中或弱堿性水溶液返藍(lán)，直到出現(xiàn)藍(lán)色為止→再次自來水沖洗1～3 min→85%的酒精3～5 min→伊紅染色3～5 min→水洗5 s→依次梯度酒精(80%、95%、100%、100%)脫水各1.5 min→二甲苯透明→二甲苯1-二甲苯2，20～30 min→中性樹膠封片。染色完成后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行圖像采集：采用數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)對皮層腦組織染色切片進(jìn)行圖像采集，每張切片先于40×鏡下觀察皮層腦組織大體形態(tài)，再隨機(jī)采集100×和400×圖片，重點(diǎn)觀察記錄400×鏡下皮層腦組織形態(tài)學(xué)改變，包括神經(jīng)元數(shù)目及排列情況、神經(jīng)元完整性、皮層透光度等。另取右腦頂葉皮質(zhì)層，1 cm3大小，放置3%戊二醛中4℃冰箱保存，每組隨機(jī)選取3塊保存在3%戊二醛中的皮層腦組織，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，脫水劑濃度梯度為30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%(100%濃度脫水3次)，脫水后的腦皮質(zhì)先后經(jīng)過脫水劑和環(huán)氧樹脂滲透液滲透，兩試劑比例分別為3∶91；1∶91；1∶93，每步30～60 min。將滲透好的組織塊放到灌有包埋液的模具中包埋，經(jīng)加溫聚合形成包埋塊。超博切片機(jī)切出50 nm左右的切片，依次醋酸鈾→檸檬酸鉛染色(染色時間：室溫下染色15～20 min)。10 000×和20 000×電鏡下隨機(jī)選取視野觀察并記錄皮層腦組織線粒體分布與結(jié)構(gòu)改變情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組大白兔MAP、G水平比較

注射LPS后，兩組大白兔MAP均降低(P<0.05)，但均高于T0(P<0.05)。復(fù)蘇治療后，兩組大白兔MAP逐漸回升，且GIK組MAP回升更明顯，在T1～T6各時間點(diǎn)均高于ES組(P<0.05)；兩組大白兔血糖均先升高后降低，且ES組T1時高于GIK組(P<0.05)，T4、T5、T6時低于GIK組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組大白兔MAP、G水平比較

2.2 兩組大白兔血清NSE濃度比較

與基礎(chǔ)值0T相比，注射LPS后ES組和GIK組血清中NSE水平均隨時間持續(xù)升高，且均高于0T(P<0.05)；T3、T6時，GIK組低于ES組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組大白兔血清NSE濃度比較

2.3 兩組大白兔氧化及抗氧化指標(biāo)比較

ES組氧化物NO、H2O2、MDA含量及iNOS活力高于GIK組(P<0.05)，抗氧化指標(biāo)SOD活力和T-AOC值低于GIK組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組大白兔氧化及抗氧化指標(biāo)比較

2.4 兩組大白兔病理結(jié)果比較

光鏡下觀察顯示，ES組皮層腦組織細(xì)胞層排列紊亂，皮質(zhì)透光度增強(qiáng)，血管間隙增大，神經(jīng)元細(xì)胞明顯腫脹，偶見神經(jīng)細(xì)胞壞死、膠質(zhì)細(xì)胞吞噬壞死神經(jīng)元細(xì)胞的衛(wèi)星現(xiàn)象。GIK組皮層腦組織細(xì)胞層排列紊亂，皮質(zhì)透光度增強(qiáng)，血管擴(kuò)張，血管間隙增寬，細(xì)胞形態(tài)未見明異常，偶有神經(jīng)細(xì)胞輕度水腫、壞死。以上結(jié)果表明兩組均存在明顯腦損傷，GIK組干預(yù)后腦損傷減輕。電鏡可見ES組部分線粒體明顯腫脹，基質(zhì)顆粒丟失嚴(yán)重，線粒體脊消失，電子密度不均勻。GIK組線粒體分布正常，線粒體脊可見，電子密度基本均勻，部分線粒體輕度腫脹、基質(zhì)粒丟失。以上結(jié)果顯示內(nèi)毒素休克兔腦組織線粒體損傷明顯，GIK組損傷輕于ES組。見圖1及圖2。

3 討論

內(nèi)毒素休克主要表現(xiàn)為嚴(yán)重低血壓、微循環(huán)障礙和多器官功能障礙，早期即可發(fā)生腦損傷，使死亡率增高，目前仍缺乏有效的治療手段，糾正低血壓、減輕氧化與抗氧化失衡可明顯減輕腦損傷。GIK由葡萄糖、胰島素和鉀組成，其中胰島素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，葡萄糖抵抗低血糖，胰島素和葡萄糖共同協(xié)助鉀從細(xì)胞外液向細(xì)胞內(nèi)液的轉(zhuǎn)運(yùn)，三種成分共同發(fā)揮生物活性且無低血糖、低鉀副作用，可改善膿毒癥患者心肌損傷及血流動力學(xué)，減輕內(nèi)毒素血癥大鼠腸道、肝臟、脾臟損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，GIK干預(yù)治療6 h內(nèi)MAP水平高于ES組，且從治療第2小時開始，GIK組MAP值穩(wěn)定在70 mmHg以上，表明GIK干預(yù)可明顯改善內(nèi)毒素休克兔血流動力學(xué)。本小組前期研究也觀察到大鼠腹腔注射LPS后2 h血糖升高，隨后血糖降低甚至發(fā)生低血糖。循證醫(yī)學(xué)證據(jù)顯示，血糖過高或過低均可導(dǎo)致內(nèi)毒素休克患者死亡率增加，維持血糖穩(wěn)定接近正常水平或許使得患者利益最大化[8]。而合適配比的GIK可避免胰島素治療后低血糖副作用的同時不影響胰島素生物學(xué)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中GIK組血糖水平更穩(wěn)定且接近正常水平(3.9～6.1 mmol/L)，證實(shí)配比的GIK成分合理。

大量研究[1-3]證實(shí)，內(nèi)毒素休克早期腦組織(尤其是皮層區(qū)和海馬區(qū))H2O2、O2-、NO、NOS合酶及ONOO-等被激活，氧化物大量堆積，SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽酶等抗氧化酶無法及時清除，氧化與抗氧化失衡發(fā)生腦損傷。MDA是氧化損傷后脂質(zhì)過氧化損傷的重要標(biāo)記物，與氧化損傷程度正相關(guān)；NSE作為腦損傷的特異性標(biāo)志物，與腦損傷程度呈正比，T-AOC可客觀評價整體抗氧化水平。本實(shí)驗(yàn)觀察到靜脈注射LPS后腦組織中氧化物NO、NOS、H2O2而SOD活性、T-AOC值降低，NSE、MDA水平增高，組織學(xué)上腦神經(jīng)元破壞明顯，證實(shí)內(nèi)毒素休克兔早期發(fā)生腦損傷，且存在氧化與抗氧化失衡?；谝葝u素有抗氧化作用，解剖上腦實(shí)質(zhì)及血腦屏障上廣泛分布GLUT和胰島素受體，葡萄糖作為腦的主要能源，可通過血腦屏障上GLUT轉(zhuǎn)運(yùn)入腦實(shí)質(zhì)，改善腦能量代謝，減輕腦損傷，葡萄糖和鉀鹽可協(xié)同增強(qiáng)胰島素的效能[9]。因此，采用GIK治療內(nèi)毒素休克兔，發(fā)現(xiàn)治療6 h后腦神經(jīng)元破壞減少，血清NSE和腦氧化物水平顯著降低，SOD和T-AOC明顯升高，表明GIK明顯減輕腦損傷，降低氧化物水平，增強(qiáng)抗氧化能力，與Muller等[10]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。另外，考慮到線粒體作為氧化物產(chǎn)生重要場所也是腦氧化損傷關(guān)鍵靶點(diǎn)[11]，線粒體損傷可進(jìn)一步佐證氧化損傷程度，設(shè)計(jì)電鏡下觀察腦線粒體超微結(jié)構(gòu)變化，證實(shí)ES組線粒體結(jié)構(gòu)破壞明顯，而GIK組明顯減輕，進(jìn)一步證實(shí)GIK可減輕內(nèi)毒素休克兔腦損傷。但由于實(shí)驗(yàn)條件限制，本實(shí)驗(yàn)未能在GIK減輕線粒體氧化損傷的具體機(jī)制方面作進(jìn)一步研究。

綜上，GIK(G:200 g/L，I：60 IU/L，KCL:60 mmol/L)可減輕LPS誘導(dǎo)內(nèi)毒素休克兔腦損傷，其可能機(jī)制為：(1)GIK可改善內(nèi)毒素休克兔血流動力學(xué)；(2)GIK降低腦氧化物水平，減輕內(nèi)毒素休克兔腦氧化損傷。