趙平偉 ,費(fèi) 強(qiáng)
(1.山西省飼料獸藥監(jiān)察所,山西太原030027;2.山西省汾陽市動物疫病預(yù)防控制中心,山西汾陽 032200)
雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)(HI試驗(yàn))是診斷新城疫疫病、掌握雞群動態(tài)、制定免疫程序的重要手段,因?yàn)槠淇旖?、成本較低、便于操作、能夠處理大量的樣品,所以成為動物疫病實(shí)驗(yàn)室常用的檢測方法。但是很多從業(yè)人員缺乏系統(tǒng)的血清學(xué)檢測知識,容易出現(xiàn)試驗(yàn)結(jié)果偏差,甚至誤判,造成新城疫的發(fā)生和流行,給雞場帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
因此,正確運(yùn)用和熟練掌握試驗(yàn)方法至關(guān)重要。筆者在長期實(shí)驗(yàn)室工作中反復(fù)操作,不斷摸索,積累了一些經(jīng)驗(yàn),原與大家共同探討。
新城疫病毒能選擇性地使某種或某幾種動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集,此即為新城疫血凝試驗(yàn)(HA試驗(yàn))。方法是用雞紅細(xì)胞與新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原作用,檢測出標(biāo)準(zhǔn)抗原血凝單位,為血凝抑制試驗(yàn)作準(zhǔn)備。而紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可于新城疫病毒懸液中加入特異性免疫血清所抑制,即為血凝抑制試驗(yàn)。方法是將檢測出血凝單位的新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原配制后與受檢血清反應(yīng),再加入紅細(xì)胞作用。血凝抑制試驗(yàn)用于檢測受檢血清抗體血凝抑制滴度,判定受檢血清抗體是否為陽性。
為使微量反應(yīng)板、移液器、吸頭保持最佳工作狀態(tài),應(yīng)建立選擇、使用、維護(hù)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序,條件允許的情況下,微量反應(yīng)板、吸頭盡量使用一次性產(chǎn)品。
反應(yīng)板最好用96孔V型板,切記不可用試管刷刷板,以免破壞孔內(nèi)壁的光滑性。板必須刷凈,不干凈的板會出現(xiàn)自凝現(xiàn)象。試驗(yàn)完畢后,用自來水反復(fù)沖洗反應(yīng)板,浸在2%鹽酸溶液中1小時,再用自來水沖洗,浸入1%氫氧化鈉 15分鐘后,拿出來用自來水沖洗,最后浸泡于蒸餾水中30分鐘以上,撈出后將孔內(nèi)水甩干凈,倒放于37℃恒溫箱中烘干備用。對底部磨損嚴(yán)重的反應(yīng)板要及時淘汰。
實(shí)驗(yàn)時應(yīng)選用數(shù)字式單道和多道移液器。平時要做好移液器的保養(yǎng)及校驗(yàn)工作,這對保證移液器的準(zhǔn)確性非常重要,每次使用完畢,要將移液器量程調(diào)至最大刻度,以保持移液器彈簧的最好靈敏度,使用前核對刻度容量與實(shí)際容量是否相符。
吸頭應(yīng)光潔平滑,能與移液器上的吸頭套密封完好。
從1日齡測定新城疫母源抗體開始,定期采樣監(jiān)測,早期每隔1~2周監(jiān)測一次,以后隨日齡的增大每3~4周測定一次。樣品應(yīng)具有足夠的數(shù)量和一定的代表性,一般萬只以上雞群按0.5%采樣,小型雞群按1%采樣。采樣時應(yīng)從雞群的多個位置抓雞,采集病、弱雞只血樣應(yīng)單獨(dú)標(biāo)明。
隨機(jī)采樣時,應(yīng)對雞群品種、日齡、疫苗種類、疫苗廠家、生產(chǎn)批號、免疫時間、免疫途徑、采樣數(shù)量等詳細(xì)登記,以便檢測后進(jìn)行結(jié)果分析和判斷,為新城疫免疫提供數(shù)據(jù)。
在翅靜脈采血時,多用一次性塑料管引流采血,其優(yōu)點(diǎn)是簡單、快速,對雞只損傷小,封口后便于攜帶、存放和分離血清。采樣時采血量不得少于管長的2/3,否則血量過少,分離到的血清不足,影響監(jiān)測結(jié)果。采血后,塑料管的一端要隨即密封,以免漏掉血清。如果用注射器采血,可用清潔、干燥無菌的小瓶盛裝,血液要放成傾斜,不能直立,否則不易分離出血清。另外還要在塑料或小瓶上標(biāo)明編號,以便區(qū)分。
除了離心分離血清外,如果想讓血清自然析出,不要馬上將血清放于冰箱內(nèi),要在室溫(20℃左右)下放置2~3小時,待血清析出后,再放入4℃冰箱內(nèi),這樣不但有利于血清的析出,又可避免血清高溫下污染變質(zhì)和溶血現(xiàn)象發(fā)生。
雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)最常用的稀釋液為0.85%的生理鹽水,要求其無菌、無雜質(zhì)。稀釋液PH值調(diào)整為7.0時,紅細(xì)胞沉降最充分,圖像最清晰,HI滴度值最大。若稀釋液偏酸性,易使紅細(xì)胞溶解;偏堿性時,吸附于紅細(xì)胞上的病毒易脫落。
不同雞的紅細(xì)胞對新城疫病毒的敏感性不同,有的雞紅細(xì)胞有自凝現(xiàn)象,有的雞紅細(xì)胞沉降慢,故試驗(yàn)時最好采3~4只成年健康公雞的血液混合,并用生理鹽水多次充分洗滌。紅細(xì)胞懸液的濃度要盡量準(zhǔn)確,如果濃度偏低,HA效價就偏高,HI效價就偏低;相反地,如果紅細(xì)胞懸液濃度偏高,HA效價就偏低,HI效價就偏高。紅細(xì)胞懸液使用時最好現(xiàn)用現(xiàn)配。
由于新城疫HI試驗(yàn)的結(jié)果判定是以完全抑制4單位抗原(4HAU)的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度的,檢測用的抗原稀釋為4單位抗原后還需要一次回歸實(shí)驗(yàn),即檢測4單位抗原是否準(zhǔn)確??乖貧w步驟如下:取50微升的生理鹽水加入微量反應(yīng)板的第1~4孔;將配制的4單位抗原50微升加入第1孔,然后依次倍比稀釋至第4孔,最后棄去50微升;4個孔再補(bǔ)加50微升生理鹽水,最后4個孔加紅細(xì)胞懸液50微升并混勻,室溫靜置30分鐘觀察結(jié)果。若第1、2孔紅細(xì)胞完全凝集,第3孔出現(xiàn)75%凝集,說明4單位抗原配制準(zhǔn)確,可用于HI試驗(yàn)。若第3孔也出現(xiàn)完全凝集,說明HA效價提高了一個滴度,需等量稀釋抗原;若只有第1孔出現(xiàn)完全凝集,說明HA效價降低了一個滴度,抗原量需要加倍。如果標(biāo)準(zhǔn)抗原血凝價偏高,測定的血清抗體效價將偏低,反之待測定的血清抗體效價偏高。所以標(biāo)準(zhǔn)抗原的配制及檢測的準(zhǔn)確性對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大影響。
微量移液器使用時有二個阻力位置,壓到第一個阻力位置為所調(diào)刻度的量值,為吸取液體時使用,再加壓力的第二個阻力位置為放液時使用。注意拇指用力,不要在吸取液體時將移液器重力壓過第一個阻力位置,否則會造成吸取液體偏多使試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。
在新城疫HI試驗(yàn)中有4次加樣步驟,即加生理鹽水、待檢血清、4單位抗原、紅細(xì)胞懸液。加樣時應(yīng)注意以下幾點(diǎn):移液器吸頭需碰觸器壁以除去多余的液體;吸頭內(nèi)液面應(yīng)保持一致;在對被檢血清進(jìn)行倍比稀釋時,吸頭要插入液面以下,避免產(chǎn)生泡沫;加4單位抗原和紅細(xì)胞懸液時,吸頭要離開液面,最好從后往前加;紅細(xì)胞懸液在試驗(yàn)時要充分搖勻等。
環(huán)境溫度對新城疫HI試驗(yàn)值的影響比較大,呈正相關(guān)。同時環(huán)境溫度影響出現(xiàn)結(jié)果的快慢,溫度高,出現(xiàn)結(jié)果快;但溫度過高,會出現(xiàn)反應(yīng)物解離和紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象,所以,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備空調(diào),將溫度控制在20℃~25℃。
在室溫下,抗原抗體作用25~30分鐘為宜,加入紅細(xì)胞懸液后,以紅細(xì)胞對照完全沉淀的前后5分鐘內(nèi)判定結(jié)果較好。判定結(jié)果偏早,所測得的結(jié)果不能反映實(shí)際抗體水平;判定時間太遲,紅細(xì)胞易發(fā)生溶血現(xiàn)象,導(dǎo)致試驗(yàn)無效。
在對照孔出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下,以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋度為該血清的血凝抑制滴度。
監(jiān)測雞群的免疫水平時,要求新城疫血凝抑制滴度大于或等于4 log2,但是抽檢樣品若有10%以上出現(xiàn)11 log2以上的高血凝抑制滴度,應(yīng)考慮雞群是否受到新城疫強(qiáng)毒感染。
全部凝集:紅細(xì)胞受到污染或保存時間過長;4單位抗原效價過高或滴加失誤;生理鹽水受到污染。
整板無凝集:4單位抗原失效;試驗(yàn)中少加4單位抗原步驟;環(huán)境溫度高,讀秒時間拖延。
跳孔:倍比稀釋時,操作順序錯亂;使用多道移液器時,每次吸取的液體量不一致;個別孔滴加4單位抗原時遺漏。
整板樣品效價為1 log2:操作時遺漏了倍比稀釋步驟。