蚊蟲嗅覺受體的研究進(jìn)展*

代玉華 趙忠懿 程 鵬 劉麗娟 公茂慶**

(1.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東省寄生蟲病防治研究所，山東濟(jì)寧 272033；2.河南出入境檢驗(yàn)檢疫局；鄭州 450003)

蚊蟲傳播的瘧疾、登革熱、黃熱病和日本腦炎等疾病每年威脅著幾億人的健康，并導(dǎo)致上百萬人的死亡。蚊媒傳染病防控的重要手段是控制蚊蟲種群數(shù)量和密度。防治媒介蚊蟲的傳統(tǒng)方法主要是采用化學(xué)殺蟲劑進(jìn)行滅殺，但化學(xué)殺蟲劑的大量使用，不僅造成環(huán)境的污染，還導(dǎo)致蚊蟲抗藥性的不斷擴(kuò)散和增強(qiáng)。如何利用蚊蟲的生理特征探索更環(huán)保、有效的防治途徑是如今研究的熱點(diǎn)。

嗅覺系統(tǒng)影響著蚊蟲對棲息地的選擇、繁殖、覓食、吸血、趨避及信息傳遞等行為。嗅覺感應(yīng)器是蚊蟲感知周圍環(huán)境中化學(xué)氣味小分子的單位，分布于蚊蟲的嗅覺系統(tǒng)——觸角與下顎須(Syedetal.,2007)。嗅覺感受器形態(tài)各異且數(shù)量很多，它們的表皮上有許多細(xì)小的孔洞，化學(xué)氣味小分子就利用這些孔洞進(jìn)入。嗅覺感受器中分布著嗅覺神經(jīng)樹突，在神經(jīng)樹突表面存在許多嗅覺受體蛋白(Olfactory receptors,ORs)，這些受體蛋白感知到化學(xué)氣味小分子后將信息傳遞到昆蟲大腦。大腦綜合了各種信息后發(fā)出指令，從而影響到蚊蟲的行為。近年來隨著生物信息學(xué)及分子生物技術(shù)的發(fā)展,蚊蟲中參與嗅覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的一些重要蛋白被克隆和鑒定。主要包括目前發(fā)現(xiàn)的嗅覺受體蛋白、氣味結(jié)合蛋白(Ordorant binding proteins,OBPs)和氣味降解酶(Odor degrading enzymes,ODEs)等。嗅覺受體作為嗅覺系統(tǒng)的關(guān)鍵成分之一，其研究是認(rèn)識蚊蟲化學(xué)信號分子識別機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，對于開發(fā)更有效的行為調(diào)控技術(shù)進(jìn)行蚊蟲防治也具有重要價值。

1 蚊蟲嗅覺受體蛋白的特征

1991年由Buck 和Axel在哺乳動物鼠類中首次發(fā)現(xiàn)OR蛋白，而昆蟲的OR蛋白是1999年由3個實(shí)驗(yàn)室同時在果蠅Drosophilamelanogaster中發(fā)現(xiàn) (Clyneetal.,1999; Gaoetal.,1999; Vosshalletal.,1999)。隨著許多生物物種的基因組被測定，目前已經(jīng)獲得1個OR大家族。在蚊蟲中，岡比亞按蚊Anophelesgambiae、埃及伊蚊Aedesaegypti、致倦庫蚊Culexpipiensquinquefasciatus分別有79、131、180個OR(Hilletal.,2002; Bohbotetal.,2007; Arensburgeretal.,2010)已經(jīng)被識別。Scialo等(2012)鑒定出首個白紋伊蚊Ae.albopictus的OR(AalOR2)。

蚊蟲的OR是一類 G蛋白偶聯(lián)蛋白(G-protein coupled receptor,GPCR)，通常具有7個跨膜區(qū)域，并分布于嗅器中的樹突表面(Hallemetal.,2006a)，整個蛋白的氨基酸殘基為400～600 個且與脊椎動物及線蟲OR的同源性極低。但也有研究報道，由于昆蟲OR蛋白的N末端在胞內(nèi)，而C末端在胞外，所呈現(xiàn)的膜拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)與哺乳動物OR截然相反，從嚴(yán)格意義上講，昆蟲的OR不應(yīng)屬于G偶聯(lián)蛋白(Bentonetal.,2006b)。在岡比亞按蚊中進(jìn)行的OR結(jié)構(gòu)分析進(jìn)一步證實(shí)昆蟲的OR不同于典型的G蛋白偶聯(lián)受體(Tsitouraetal.,2010)。昆蟲氣味受體的類型可以分為7次跨膜受體、昆蟲味覺受體、谷氨酸受體和離子型受體(Kauppetal.,2010)。

2 嗅覺受體的表達(dá)與功能

昆蟲的一個嗅覺神經(jīng)元可以表達(dá)1～3個OR蛋白(Vosshalletal.,1999)，而哺乳動物的一個神經(jīng)元只表達(dá)一種受體蛋白(Mombaerts,2004)。盡管多數(shù)生物都表達(dá)數(shù)百種OR 蛋白,但氣味分子的數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于OR 的數(shù)目。每種OR可以感受多種氣味分子，多種OR還可以感受同一種氣味分子，由此不同的OR 組合就可以檢測不同的氣味分子(Malnicetal.,1999)。數(shù)量有限的OR可以通過變化不同組合來檢測所有氣味分子。這樣組成了感受化學(xué)信息的編碼譜(Dobritsaetal.,2003; Hallemetal.,2006a,2006b; Vosshalletal.,2007)。

有些OR 基因可以進(jìn)行共表達(dá)。在對岡比亞按蚊CO2受體的研究中發(fā)現(xiàn)，可感受CO2的受體基因Gr21a和Gr63a，GPRGR22 和GPRGR24 表現(xiàn)出共表達(dá)(Jonesetal.,2007)。還有研究發(fā)現(xiàn)OR 基因的表達(dá)有一定的性別依賴性。采用RT-PCR 和qRT-PCR 技術(shù)來比較雄性按蚊和雌性按蚊OR mRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示宿主氣味物質(zhì)更容易激活雌性個體OR 的表達(dá)(Iatrouetal.,2008)。另外，OR 基因的表達(dá)與昆蟲宿主之間還存在協(xié)同進(jìn)化的現(xiàn)象，宿主的種類和數(shù)量會影響OR基因的表達(dá)(Mcbrideetal.,2007)。

第一個獲得功能鑒定的昆蟲OR是果蠅Or43a。Wetzel 等(2001)在非洲蟾蜍卵母細(xì)胞中注射Or43a cRNA 和G 蛋白的Gα15 亞基， 雙電極電壓鉗的結(jié)果顯示，較低濃度的環(huán)己酮、環(huán)己醇、苯甲醛和苯甲醇等氣味分子即可激活Or43a 受體，而1，3-環(huán)己二酮、1，4-環(huán)己二酮、甲苯、3-苯甲醛、苯乙醛和正己醇等類似物卻不能激活它們。

OR2是蚊蟲中進(jìn)行功能研究較多的OR蛋白。Carey等(2010)利用膜片鉗技術(shù)，在爪蟾卵細(xì)胞中表達(dá)岡比亞按蚊的OR復(fù)合物，研究結(jié)果表明，同果蠅一樣，岡比亞按蚊的OR復(fù)合物也分為兩種類型，識別譜較窄的受體(Specialist)和廣譜識別受體(Generalist)。每一種岡比亞按蚊的OR都有特定的氣味反應(yīng)特征和識別范圍，并且，有些氣味可以激活某些嗅覺神經(jīng)元而抑制其他嗅覺神經(jīng)元。在岡比亞按蚊中，AgOR2屬于識別譜較窄的受體，對一部分氣味產(chǎn)生反應(yīng)，如：庫蚊的產(chǎn)卵引誘劑，與人類汗液氣味有30%相似性的吲哚(Meijerinketal.,2001)。Xia等(2008)發(fā)現(xiàn)，AgOR2不但在岡比亞按蚊成蟲中表達(dá)，也在幼蟲中表達(dá)，并參與2-甲酚、苯甲醛、吲哚和3-甲基吲哚的識別。有研究表明，致倦庫蚊(Pelletieretal.,2010)和埃及伊蚊(Bohbotetal.,2011a)的OR2同源性較高，且都對吲哚產(chǎn)生反應(yīng)。Scailo等(2012)從白紋伊蚊中克隆出第一個OR蛋白AalOR2，它對吲哚具有識別特性，該蛋白在幼蟲頭部和成蚊觸角中表達(dá)，且與其他蚊蟲的OR2同源性較高，說明OR2是蚊蟲OR蛋白家族中的重要保守蛋白。

利用爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)岡比亞按蚊的OR(AgORs)，研究OR的改變帶來的影響，結(jié)果表明OR不僅參與對抗、逃逸等行為，還參與蚊蟲間的合作行為，暗示利用阻斷OR途徑，可控制蚊蟲行為，開拓蚊蟲防制的新思路(Bohbotetal.,2012)。

有關(guān)昆蟲OR在神經(jīng)系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，一般認(rèn)為與哺乳動物的OR相同，是引起G偶聯(lián)蛋白的β亞基或α亞基分離，通過改變離子通道，再引起動作電位。然而，有研究表明，利用基因敲除技術(shù)和膜片鉗技術(shù)，發(fā)現(xiàn)昆蟲的OR在信號傳導(dǎo)中有其特殊性，即OR可以直接作為離子通道，而引起動作電位(Satoetal.,2008; Wicheretal.,2008)，這一發(fā)現(xiàn)豐富了人類認(rèn)識動物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制。

3 Or83b蛋白

OR基因在不同物種之間的同源性比較低，但有一個例外，那就是結(jié)構(gòu)和功能高度保守的Or83b。它存在于幾乎所有的昆蟲中(Larssonetal.,2004; Jonesetal.,2005；Hallemetetal.,2006b; Xiaetal.,2006)，形成了一個特殊的Or83b 家族。這種在不同昆蟲種間高度保守的 OR首先在果蠅基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)，命名為DOR83b(Vosshalletal.,1999)。目前國內(nèi)外已從雙翅目、鱗翅目、膜翅目和鞘翅目等一些昆蟲中發(fā)現(xiàn)這種基因(Hilletal.,2002; Kriegeretal.,2003; Xiaetal.,2006; 王妮娜等，2008; Jordanetal.,2009)。Or83b受體的另一個特征是在很多昆蟲種類中，不同昆蟲間氨基酸序列表現(xiàn)出約70%的同源性(Hilletal.,2002; Kriegeretal.,2003; Pittsetal.,2004)；對水稻害蟲的研究發(fā)現(xiàn)，鱗翅目昆蟲之間該基因的氨基酸序列相似性達(dá)94%，與致倦庫蚊、岡比亞按蚊、埃及伊蚊相比，氨基酸序列相似性達(dá)到83%。

這種在各類昆蟲中同源性高的、在進(jìn)化中保留下來的OR，則可能在昆蟲的嗅覺中起著獨(dú)特和基礎(chǔ)的作用。以果蠅、岡比亞按蚊和夜蛾等昆蟲為實(shí)驗(yàn)材料，利用基因缺失突變體研究這幾種昆蟲氣味受體的功能，將其Or83b 基因敲除后，突變體表現(xiàn)出嗅覺相關(guān)行為功能被嚴(yán)重削弱,而基因拯救后可以恢復(fù)正常(Larssonetal.,2004; Jonesetal.,2005)，表明Or83b 基因在昆蟲嗅覺行為中具有重要作用(Wicheretal.,2008)。推測Or83b受體可能具有以下兩種功能：一是在某個嗅覺感受神經(jīng)元內(nèi)它能夠獨(dú)立地結(jié)合特殊的配體，而和它共表達(dá)的其他OR則不能結(jié)合；二是它可能協(xié)助其他的OR基因，通過與其二聚體化來識別多樣的氣味物質(zhì)(Larssonetal.,2004)。相對單獨(dú)表達(dá)普通氣味受體對氣味分子的反應(yīng)來說，在異源表達(dá)系統(tǒng)(Heterologous expression system)中共表達(dá)Or83b和普通氣味受體后，對氣味分子的識別反應(yīng)顯著增強(qiáng)，暗示Or83b 和普通氣味受體形成的復(fù)合物可能是昆蟲感受氣味分子的真正受體(Nakagawaetal.，2005；Satoetal.，2008)。在不表達(dá)Or83b 受體家族的昆蟲嗅覺感覺神經(jīng)元中，也存在著多種受體以復(fù)合物的形式來完成對氣味分子的感受功能(Kwonetal.，2007；Jonesetal.，2007；Bentonetal.，2009)。

另外，在研究岡比亞按蚊和果蠅對CO2的識別功能時，發(fā)現(xiàn)這種識別作用依賴于兩種非Or83b 嗅覺受體，這兩種受體在同一個神經(jīng)元內(nèi)共表達(dá)(Jonesetal.,2007)。這個實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明昆蟲神經(jīng)—受體一對一表達(dá)很可能不是唯一的方式，也暗示昆蟲嗅覺基因的表達(dá)調(diào)控更為復(fù)雜。

4 神經(jīng)膜蛋白(Sensory neuron membrane protein,SNMP)

在鱗翅目昆蟲嗅覺的研究中，從美洲野蠶Antheraeapolyphemus嗅覺感受神經(jīng)元細(xì)胞膜提取物中純化并克隆了一組SNMP，免疫學(xué)分析表明該蛋白只在嗅覺感受器纖毛、樹突和神經(jīng)元胞體中存在(Rogersetal.,1997)。序列分析表明它存在兩個跨膜結(jié)構(gòu)和一個較大的胞外環(huán)，類似于脊椎動物CD36家族的蛋白(一種類似于受體的膜蛋白)。CD36 家族是可以結(jié)合并且運(yùn)輸脂肪的跨膜蛋白,這類蛋白的功能是識別細(xì)菌的受體,在免疫系統(tǒng)中的組成部分(Vosshalletal.，2007)。SNMPs 的功能是運(yùn)載氣味分子，并且與嗅覺神經(jīng)元細(xì)胞外的蛋白(如OBPs)、細(xì)胞膜上蛋白(Ors)以及胞質(zhì)蛋白相互作用(Bentonetal.,2007)。Nichols 等(2008)從果蠅、岡比亞按蚊和埃及伊蚊等基因組中分別鑒定了12～14種SNMP/CD36類似物。Jin 等(2008)發(fā)現(xiàn)SNMP 對于果蠅的性信息素感受神經(jīng)元感受性信息素cVA 是必要的，但是對于感受一般氣味分子是不必要的。從組織分布推測SNMP可能是OR的一種。這些發(fā)現(xiàn)不僅有助于對OR功能特性的研究，更促進(jìn)了對嗅覺途徑的多樣性的認(rèn)識。

5 蚊蟲驅(qū)避劑

目前仍占有一定市場的蚊蟲驅(qū)避劑包括驅(qū)蚊胺(N,N-Diethyl-meta-toluamide,DEET)、羥哌酯(2-(2-羥乙基)-哌啶-1-碳酸-1-甲基異丙酯，KBR3023)、驅(qū)蚊酯(3-(N-正丁基乙酰胺基)-丙酸乙酯，IR3535)等。驅(qū)蚊胺是市場份額最大的驅(qū)蚊制品(Katzetal.,2008)，這種化合物的作用機(jī)理一直沒有定論。一種說法是蚊蟲不喜歡驅(qū)蚊胺的氣味，另一種說法是它屏蔽蚊蟲對其他化學(xué)氣味的感知。研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用一些化學(xué)氣味時，蚊蟲的嗅覺系統(tǒng)會產(chǎn)生明顯的神經(jīng)反應(yīng)，而這些化學(xué)氣味與驅(qū)蚊胺一起使用時，蚊蟲的神經(jīng)反應(yīng)顯著減弱。說明驅(qū)蚊胺明顯干擾蚊蟲對其他化學(xué)小分子的感知能力，從而認(rèn)為驅(qū)蚊胺屏蔽了蚊蟲的嗅覺系統(tǒng)(Ditzenetal.,2008)，但也有報道稱是由于驅(qū)蚊胺吸附了其他化學(xué)分子從而降低了它們發(fā)揮的量，才導(dǎo)致蚊蟲的神經(jīng)反應(yīng)能力下降(Syedetal.,2008)。還有研究認(rèn)為多種驅(qū)避劑的作用機(jī)制是抑制氣味引發(fā)的OR介導(dǎo)的電流(Bohbotetal.，2011b)。

蚊蟲的氣味受體復(fù)合體包括一個特異性O(shè)R(ORx)和一個共受體(Orco)，細(xì)胞表面的神經(jīng)傳輸和信號轉(zhuǎn)換都需要Orco的參與。在埃及伊蚊體內(nèi)，驅(qū)蚊胺是通過降低嗅覺感受神經(jīng)(ORN)對于乳酸(Bernier,2002)的敏感閾值表現(xiàn)對已有氣味的抑制作用。驅(qū)蚊胺選擇性的抑制氣味介導(dǎo)的OR8，而驅(qū)蚊酯、羥哌酯抑制OR2和OR8，3種驅(qū)避劑都不作用于共同受體Or83b(Ditzenetal.,2008; Bohbotetal.，2010; Bohbotetal.，2011b)。此外，驅(qū)蚊胺和驅(qū)蚊酯的識別位點(diǎn)并不在Orco上，且對Orco 無親和力(Bohbotetal.，2012)。

2011年美國范德比爾特大學(xué)的研究人員在研究蚊蟲嗅覺基本原理時發(fā)現(xiàn)一種化合物驅(qū)避劑，命名為VUAA1，這是一類新的嗅覺共受體激動劑，該類化合物具有比驅(qū)蚊胺強(qiáng)1 000倍的效果(Jonesetal.,2011)。與傳統(tǒng)驅(qū)避劑不同，VUAA1的原理是直接激活Orco而不是單獨(dú)激活某個ORx，它刺激所有的ORx-Orco連接。從理論上講，VUAA1理論上可以激動所有表達(dá)Orco的ORNs，使蚊蟲覺得這種“氣味”是超負(fù)荷的存在，由此使蚊蟲基本喪失嗅覺分辨力，辨別不出血液或者其他任何味道，也就無法搜尋到人體(向婧潔等，2013)。

6 展望

嗅覺系統(tǒng)在蚊蟲的生命活動中起著關(guān)鍵作用，直接影響蚊蟲感受外界環(huán)境和尋找宿主等行為。OR在嗅覺系統(tǒng)中占據(jù)十分重要的地位。近年來在OR結(jié)構(gòu)、受體蛋白、表達(dá)及功能等方面進(jìn)行了大量研究并取得進(jìn)展，但是，有關(guān)蚊蟲OR的作用機(jī)制、表達(dá)調(diào)控等諸多問題亟待探索?；贠R的蚊蟲驅(qū)避劑研究初步表明，通過作用于OR可以形成對蚊蟲嗅覺系統(tǒng)的干擾甚至阻斷，也預(yù)示著以O(shè)R為基礎(chǔ)研發(fā)高效廣譜性蚊蟲驅(qū)避劑成為可能。同時，蚊蟲OR的研究，也為建立OR介導(dǎo)的蚊媒病傳播阻斷途徑提供科學(xué)依據(jù)。