長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)過程中及運(yùn)動(dòng)后不同來源ROS介導(dǎo)大鼠骨骼肌核因子Kappa B核轉(zhuǎn)入

廖鵬，何慶華，彭海燕，李飛飛，邢桂磊，張勇

長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)過程中及運(yùn)動(dòng)后不同來源ROS介導(dǎo)大鼠骨骼肌核因子Kappa B核轉(zhuǎn)入

廖鵬1，何慶華2，彭海燕2，李飛飛2，邢桂磊2，張勇3

目的：觀察長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)過程中和運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌不同來源ROS與核因子Kappa B（NFκB）核轉(zhuǎn)入的關(guān)系。方法：3月齡雌性SD大鼠30只隨機(jī)分為5組（n=6）。6只大鼠作為不運(yùn)動(dòng)對(duì)照（C），安靜狀態(tài)下處死；其余大鼠以25 m/min、-10%跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，分別于運(yùn)動(dòng)1 h（E1 h）、運(yùn)動(dòng)2 h（E2 h）、運(yùn)動(dòng)2 h后6 h（E2 h+6）和24 h（E2 h+24）處死動(dòng)物。結(jié)果：（1）E1 h、E2 h和E2 h+24骨骼肌核蛋白p65表達(dá)量較C顯著提高，E2 h+6核p65表達(dá)量較E2 h顯著降低；（2）骨骼肌順烏頭酸酶活性在E1 h、E2 h和E2 h+6較C顯著降低，在E2 h+6和E2 h+24較E2 h顯著提高；（3）E2 h+24骨骼肌H2O2含量較C顯著升高；（4）E2 h+24骨骼肌髓過氧化物酶活性較C和E2 h顯著提高；（5）各組骨骼肌MnSOD mRNA表達(dá)量無組間差異，但E2 h、E2 h+6和E2 h+24骨骼肌TNF mRNA表達(dá)量較C顯著提高；（6）血清HMGB1含量C組顯著低于E1 h、E2 h和E2h+24；E2 h+24較E2 h顯著提高；（7）隨運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)后時(shí)間延長，骨骼肌形態(tài)學(xué)異常及炎細(xì)胞浸潤逐漸增多。結(jié)論：來自骨骼肌線粒體和呼吸爆發(fā)的ROS可能先后分別參與了運(yùn)動(dòng)過程和運(yùn)動(dòng)后2次NFκB核轉(zhuǎn)入的觸發(fā)。

氧化還原狀態(tài)；線粒體；延遲性肌肉損傷；呼吸爆發(fā)；p65

骨骼肌的劇烈收縮會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞啟動(dòng)和關(guān)閉一系列基因的表達(dá)以應(yīng)答運(yùn)動(dòng)應(yīng)激[1]。NFκB是一種具備多向調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，其活化及失活是細(xì)胞應(yīng)答運(yùn)動(dòng)的最重要基礎(chǔ)之一[2-3]。NFκB活化的關(guān)鍵步驟是由胞漿轉(zhuǎn)位入核，這一過程由細(xì)胞親氧化狀態(tài)啟動(dòng)，應(yīng)激刺激嚴(yán)重時(shí)一些炎癥因子（如HMGB1）也參與這一過程[3]。但是，已知多途徑參與運(yùn)動(dòng)骨骼肌ROS生成[5]，不同來源的ROS是否都參與運(yùn)動(dòng)應(yīng)激中NFκB核轉(zhuǎn)入，何時(shí)參與，貢獻(xiàn)如何，目前并無證據(jù)給出明確解釋。

長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致線粒體ROS大量生成，同時(shí)造成骨骼肌損傷又會(huì)引起延遲性呼吸爆發(fā)。本研究的目的是觀察由長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的不同ROS來源對(duì)NFκB核轉(zhuǎn)入的影響，這一問題的探索無疑會(huì)對(duì)深化理解NFκB這一多種病理生理干預(yù)靶向做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3月齡健康雌性SD大鼠30只，體重（278.7±16.3）g（250～ 300 g），購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)0047959，在通風(fēng)、溫度、濕度適宜的動(dòng)物室內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2 運(yùn)動(dòng)模型及分組

新環(huán)境飼養(yǎng)1周后，所有SD大鼠每日以15 m/min、0%坡度運(yùn)動(dòng)15 min。1周后重新稱重，將30只大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，分別于跑臺(tái)以25 m/min、-10%坡度運(yùn)動(dòng)。以運(yùn)動(dòng)前安靜狀態(tài)（C）、運(yùn)動(dòng)1 h（E1 h）、運(yùn)動(dòng)2 h（E2 h）、運(yùn)動(dòng)2 h后6 h（E2 h+6）和運(yùn)動(dòng)2 h后24 h（E2 h+24）為實(shí)驗(yàn)觀測(cè)記錄點(diǎn)。運(yùn)動(dòng)過程采用聲音或毛刷刺激大鼠尾部，所有運(yùn)動(dòng)動(dòng)物均能完成設(shè)定時(shí)間的運(yùn)動(dòng)。

1.3 組織準(zhǔn)備

于各實(shí)驗(yàn)觀測(cè)點(diǎn)10%水合氯醛麻醉后活殺動(dòng)物，腹主動(dòng)脈穿刺取血分離血清，-20℃保存，取股外側(cè)肌肉10%甲醛鈣固定或-80℃保存。

1.4 骨骼肌核蛋白抽提

用Pierce NE-PER?Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents kit進(jìn)行核蛋白抽提。

1.5 骨骼肌線粒體抽提

緩沖介質(zhì)沖洗骨骼肌后勻漿，4℃600 g離心；薄紗布過濾后4℃1 7000 g離心；5 mL緩沖介質(zhì)懸浮線粒體沉淀。

1.6 骨骼肌NFkB亞基p65核蛋白表達(dá)量測(cè)定

Western Blot測(cè)定骨骼肌細(xì)胞核NFkB亞基p65核蛋白表達(dá)量。核蛋白定量后，常規(guī)電泳分離、轉(zhuǎn)膜；Rabbit Anti-NFκB p65 IgG、和Mouse Anti-α-Tubulin IgG分別用PBST稀釋成1：100和1：500的工作液，Goat Anti Rb IgG-HRP和Goat Anti Mouse IgG-HRP用PBST稀釋成1：10 000和1：2 000的工作液；一抗室溫孵育2 h，二抗室溫孵育1 h；以ECL反應(yīng)液做發(fā)光底物，反應(yīng)后與X光膠片壓片、顯影、定影；以凝膠成像系統(tǒng)拍片。

1.7 骨骼肌線粒體順烏頭酸酶相對(duì)活性測(cè)定

取線粒體加入細(xì)胞裂解液提取順烏頭酸酶；加反應(yīng)緩沖液測(cè)反應(yīng)體系240 nm下1 min中內(nèi)吸光值變化。以各實(shí)驗(yàn)觀測(cè)點(diǎn)吸光度變化相對(duì)于安靜狀態(tài)吸光度變化的比值反映順烏頭酸酶相對(duì)活性。

1.8 骨骼肌髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）活性測(cè)定

按南京建成生物工程研究所試劑盒說明將定量骨骼肌蛋白及各種試劑按比例混合、分步驟反應(yīng)。460 nm處測(cè)OD值，以每克蛋白在37℃反應(yīng)體系中H2O2被分解1 mmol定義為1個(gè)MPO活性單位（U/mg pro）。

1.9 骨骼肌H2O2含量測(cè)定

按南京建成生物工程研究所試劑盒說明將骨骼肌蛋白及各種試劑按比例混合、分步驟反應(yīng)后，于405 nm處測(cè)吸光度值，H2O2含量單位為nmol/mg pro。

1.10 骨骼肌MnSOD、TNFa mRNA表達(dá)量測(cè)定

實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于檢測(cè)骨骼肌MnSOD、TNFa基因表達(dá)。取骨骼肌液氮下研磨，加1mlTrizol勻漿，抽提總RNA。瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶完整性，測(cè)OD260/280值>1.8，計(jì)算RNA含量。

取2 ug RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物序列：MnSOD，上游5'-AGAGTTGCTGGAGGCTATCAAG-3'，下游50-CAGTGGGT CCTGATTAGAGCA-3'；TNFa，上游5'-TACTGAACTTCGGGG TGATTGGTCC-3'，下游5'-CTTGGCCAGCGCCTCGTGGT-3'；β-Actin，上游5'-TGGTGGGTATGG GTCAGAAGGACTC-3'，下游5'-CATGGCTGGGGT GTT GAAGGTCTCA-3'。

cDNA樣品與SYBR GREEN、上游和下游引物混合，短暫離心后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。以β-Actin為內(nèi)參，根據(jù)公式2-□□Ct計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.11 血清HMGB1含量

血清HMGB1含量按Shino-Test公司的ELISA試劑盒說明測(cè)定。酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處吸光值，血清中HMGB1濃度與顏色的深淺、OD值大小呈正相關(guān)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值，計(jì)算樣本中HMGBl含量。

1.12 骨骼肌形態(tài)學(xué)變化

骨骼肌固定、切片后HE染色觀察形態(tài)學(xué)改變。動(dòng)物麻醉后迅速取骨骼肌切塊，10%甲醛鈣固定；修整、脫水、透明、浸蠟后制成蠟塊，切片4 μm厚。切片二甲苯I、II、III脫蠟，梯度酒精脫水；蘇木素、伊紅染色；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡觀察。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。F值顯著性（P<0.05），用Bonferroni（方差具有齊次性）或Tamhane（方差不具齊次性）進(jìn)行2組間差異的檢驗(yàn)。所有檢驗(yàn)的顯著性水平定為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌NFkB亞基p65核蛋白表達(dá)量

E1h（P<0.01）、E2 h（P<0.01）和E2 h+24（P<0.01）骨骼肌細(xì)胞核NFκB亞基p65表達(dá)量較C顯著提高，E2 h+6（P<0.01）核p65表達(dá)量較E2 h顯著降低（見圖1）。

圖1 長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌細(xì)胞核p65表達(dá)量的影響Figure1 Western blot analysis of p65 in the nuclear extraction of rat skeletal muscle withtubulin served as control

2.2 骨骼肌線粒體順烏頭酸酶活性

E1h（P<0.05）、E2 h（P<0.05）和E2 h+6（P<0.05）骨骼肌線粒體順烏頭酸酶活性較C顯著降低；E2 h+6（P<0.05）和E2 h+24（P<0.05）順烏頭酸酶活性較E2 h顯著升高（見圖2）。

圖2 長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌線粒體順烏頭酸酶活性的影響Figure2 Activities of mitochondrial aconitase in rat skeletal muscle

2.3 骨骼肌MPO活性

E2 h+24骨骼肌MPO活性較C（P<0.05）和E2 h（P<0.05）顯著升高（見圖3）。

圖3 長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌MPO活性的影響Figure3 Activities of MPO in rat skeletal muscle

2.4 骨骼肌H2O2含量

E2 h+24骨骼肌H2O2含量較C（P<0.05）顯著升高（見圖4）。

圖4 長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌H2O2含量的影響Figure4 Concentrations of H2O2in rat skeletal muscle

2.5 骨骼肌MnSOD及TNFa mRNA表達(dá)

骨骼肌MnSOD mRNA表達(dá)量無組間差異（見圖5）。E2 h、E2 h+6和E2 h+24骨骼肌TNFa mRNA表達(dá)量較C顯著提高（P<0.05）；E2 h+6和E2 h+24骨骼肌TNFa mRNA表達(dá)量較E2 h顯著提高（P<0.05）（見圖5）。

2.6 血清HMGB1含量

E1 h（P<0.05）、E2 h（P<0.01）和E2 h+24（P<0.01）血清HMGB1含量較C顯著提高；E2 h+6血清HMGB1含量較E2 h顯著降低（P<0.01）；E2 h+24血清HMGB1含量較E2 h顯著提高（P<0.01）（見圖6）。

圖5 長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌MnSOD和TNF mRNA含量的影響Figure5 Real-time PCR analysis of MnSOD and TNF in rat skeletal muscle

圖6 長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)對(duì)血清HMGB1含量的影響Figure6 Serum HMGB1concentrations during and after downhill running

2.7 骨骼肌的形態(tài)學(xué)變化

HE染色C組表現(xiàn)正常骨骼肌細(xì)胞形態(tài)（見圖7A），Ex1 h組骨骼肌細(xì)胞橫紋偶見灶性模糊（見圖7B），E2 h組骨骼肌細(xì)胞見散在橫紋消失及間質(zhì)充血（見圖7C），E2+6 h部分骨骼肌細(xì)胞橫紋消失（見圖7D）。間質(zhì)散在血管擴(kuò)張充血及炎細(xì)胞浸潤，E2 h+ 24組骨骼肌細(xì)胞橫紋大部分消失，胞漿淡染，核中移，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤（見圖7E）。

圖7 長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)前后骨骼肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化Figure7 Hematoxylin and eosin stain of skeletal muscle in rats

3 討論

哺乳動(dòng)物NFκB異源二聚體p50/p65只有從胞漿轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核才能與應(yīng)答元件結(jié)合啟動(dòng)和/或關(guān)閉靶基因表達(dá)[2-3]。這一過程需要細(xì)胞的氧化環(huán)境觸發(fā)一系列激酶反應(yīng)，最終通過胞漿p50/p65抑制因子IκB的酶解，暴露出p65的核定位信號(hào)并被轉(zhuǎn)運(yùn)受體識(shí)別后才能發(fā)生，核p65蛋白表達(dá)量的顯著提高是其重要標(biāo)志[3]。ROS是哺乳動(dòng)物骨骼肌細(xì)胞最重要的氧化劑，也是細(xì)胞氧化還原狀態(tài)最重要的調(diào)節(jié)因子[4-5]。但是，骨骼肌細(xì)胞存在多種ROS生成途徑[5]，這些途徑生成的ROS是否都參與、何時(shí)參與NFκB核轉(zhuǎn)入、參與程度如何，目前并無研究做出滿意解釋。

線粒體呼吸鏈電子漏出和呼吸爆發(fā)是長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)骨骼肌ROS的2個(gè)主要生成途徑[4-5]。長時(shí)間的骨骼肌收縮在提高線粒體呼吸鏈能量轉(zhuǎn)換效率的同時(shí)會(huì)通過電子漏生成大量ROS，而長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)又會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)骨骼肌微損傷，誘發(fā)延遲性呼吸爆發(fā)及炎癥反應(yīng)，積極參與對(duì)損傷骨骼肌的修復(fù)[6]。

超氧陰離子（O2—.）是線粒體電子漏生成的第一個(gè)ROS，可特異性氧化順烏頭酸酶活性基團(tuán)鐵硫簇[7]。線粒體順烏頭酸活性水平與O2—.生成速率呈反比，能夠精確反映線粒體ROS的生成速率[8]。本研究觀察到，運(yùn)動(dòng)過程中線粒體順烏頭酸酶活性的顯著降低一直持續(xù)到2 h運(yùn)動(dòng)后6 h，至2 h運(yùn)動(dòng)后24 h其活性又恢復(fù)正常。表明，在長時(shí)間有氧運(yùn)動(dòng)過程中顯著提高的線粒體ROS生成速率一直持續(xù)至運(yùn)動(dòng)后，但隨運(yùn)動(dòng)結(jié)束時(shí)間的延長，伴隨骨骼肌能量需求相對(duì)降低，線粒體ROS生成速率又降低至安靜水平。

MPO是細(xì)胞呼吸爆發(fā)的標(biāo)志酶[6]。長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)造成的運(yùn)動(dòng)骨骼肌微損傷會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞炎癥等保護(hù)機(jī)制。炎癥部位的趨化吞噬細(xì)胞釋放蛋白酶和產(chǎn)生大量氧代謝物易化清除、吞噬異物。其中，吞噬細(xì)胞MPO利用NADPH氧化酶催化生成的H2O2和氯離子產(chǎn)生次氯酸，形成更具氧化活性的自由基。因此，MPO活性提高意味著大量ROS生成，是趨化吞噬細(xì)胞的功能和激活標(biāo)志。本研究觀察到，離心運(yùn)動(dòng)后24 h骨骼肌MPO活性較運(yùn)動(dòng)前和運(yùn)動(dòng)過程顯著升高，表明本研究離心運(yùn)動(dòng)模式確實(shí)誘導(dǎo)了延遲性呼吸爆發(fā)。的確如此，在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)（運(yùn)動(dòng)后24 h），確實(shí)觀察到骨骼肌H2O2含量較運(yùn)動(dòng)前顯著升高。形態(tài)學(xué)證據(jù)也表明，隨運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)后時(shí)間延長，運(yùn)動(dòng)骨骼肌細(xì)胞損傷和炎癥細(xì)胞浸潤程度逐漸加重。

但是，本研究離心運(yùn)動(dòng)至結(jié)束后6 h內(nèi)并未出現(xiàn)骨骼肌H2O2含量的顯著性改變。提示，骨骼肌氧還狀態(tài)并未隨運(yùn)動(dòng)過程中線粒體ROS生成速率的顯著提高而改變。事實(shí)上，細(xì)胞ROS生成速率的提高并不總意味著其細(xì)胞水平的顯著改變。運(yùn)動(dòng)過程中細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)總是努力將氧化還原狀態(tài)維持在穩(wěn)定水平，NFκB的核轉(zhuǎn)入活化參與這一穩(wěn)態(tài)平衡的維持[1，5]。

本研究的重要結(jié)果是，與長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)中和運(yùn)動(dòng)后24 h先后觀察到的2個(gè)不同來源的ROS生成增多峰相對(duì)應(yīng)，運(yùn)動(dòng)骨骼肌細(xì)胞NFκB亞基p65的核蛋白表達(dá)量也在運(yùn)動(dòng)過程中和運(yùn)動(dòng)后24 h先后依次顯著提高。表明，運(yùn)動(dòng)過程中和運(yùn)動(dòng)后24 h先后依次出現(xiàn)了2次胞漿NFκB的核轉(zhuǎn)入，且這2次NFκB核轉(zhuǎn)入可用長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)中和運(yùn)動(dòng)后不同來源的ROS解釋。

NFκB是一個(gè)多效能的轉(zhuǎn)錄因子，可接受上百種細(xì)胞刺激，參與啟動(dòng)上百個(gè)基因的表達(dá)[2]。如果2個(gè)不同來源的ROS先后分別參與啟動(dòng)NFκB在運(yùn)動(dòng)過程中和運(yùn)動(dòng)后的2階段活化的話，必然有其特殊的生理意義。本文認(rèn)為，NFκB在運(yùn)動(dòng)過程中的第1次活化可能與細(xì)胞對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激的快速應(yīng)答有關(guān)[1]。這一細(xì)胞生理過程可能涉及能量轉(zhuǎn)換、氧化還原穩(wěn)態(tài)以及肌肉、血管和氧張力調(diào)節(jié)等各個(gè)方面。作為NFκB靶點(diǎn)的一些轉(zhuǎn)錄因子、抗氧化酶、急性期蛋白、低氧誘導(dǎo)因子乃至一些早期炎癥因子在長時(shí)間運(yùn)動(dòng)中的表達(dá)無不與之有關(guān)。

為驗(yàn)證上述推論，在本研究中觀察了NFκB的2個(gè)靶基因MnSOD和TNFa mRNA在運(yùn)動(dòng)前后骨骼肌的表達(dá)量變化。Mn-SOD在線粒體歧化超氧陰離子為過氧化氫而阻止通過Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生更為活躍的ROS羥自由基，而運(yùn)動(dòng)過程中線粒體是超氧陰離子的主要來源，但是沒有觀察到MnSOD mRNA在運(yùn)動(dòng)前后的顯著性差異。事實(shí)上，多數(shù)研究都注意到急性運(yùn)動(dòng)過程中MnSOD基因表達(dá)量不會(huì)出現(xiàn)顯著變化。HOLLANDER等[9]觀察到，急性力竭運(yùn)動(dòng)活化骨骼肌NFκB，而MnSOD mRNA表達(dá)量較安靜狀態(tài)的顯著提高出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后1～2 h。此外，可能有氧運(yùn)動(dòng)過程中機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)足以對(duì)抗伴隨的氧化應(yīng)激。本研究中，線粒體ROS生成速率在運(yùn)動(dòng)過程中升高，但H2O2水平維持不變也似乎支持這一假設(shè)。

TNFa是公認(rèn)的早期促炎因子，在組織炎癥、細(xì)胞趨化、免疫介導(dǎo)、損傷修復(fù)等一系列非特異性應(yīng)激應(yīng)答中扮演重要角色。本研究觀察到，TNFa mRNA表達(dá)量隨運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)后時(shí)間延長逐漸增高。NFκB在運(yùn)動(dòng)中的活化選擇性啟動(dòng)靶基因表達(dá)值得關(guān)注。

NFκB諸多抑制因子也是其自身的靶基因。NFκB活化的觸發(fā)因素一旦去除，如本研究中線粒體ROS生成速率下降時(shí)，這些前期表達(dá)的NFκB抑制因子會(huì)迅速入核將p65核轉(zhuǎn)出[10]。這可能是本研究運(yùn)動(dòng)后6 h骨骼肌細(xì)胞核p65蛋白表達(dá)量下降的原因。

但是TNFa mRNA表達(dá)量為什么在NFκB核轉(zhuǎn)入減弱后仍隨運(yùn)動(dòng)后時(shí)間延長逐漸增高？骨骼肌長時(shí)間的拉長式收縮還會(huì)導(dǎo)致延遲性呼吸爆發(fā)，其ROS生成速率和量顯著高于線粒體呼吸鏈，很可能是本研究運(yùn)動(dòng)后24 h H2O2水平顯著提高的原因。近期研究表明，呼吸爆發(fā)而非線粒體呼吸鏈來源的ROS才是損傷組織免疫、修復(fù)的重要原因[11]。在運(yùn)動(dòng)后24 h觀察到的NFκB第2次核轉(zhuǎn)入很可能由呼吸爆發(fā)生成的ROS參與觸發(fā)。此次，NFκB活化的生理意義可能涉及免疫與修復(fù)，主要表現(xiàn)為次晚期和晚期炎癥因子、抗氧化酶類等細(xì)胞因子的表達(dá)[12]，是機(jī)體對(duì)不適宜運(yùn)動(dòng)適應(yīng)的重要細(xì)胞事件。

本研究另一重要結(jié)果是，血清HMGB1含量也出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)前后2次升高，且運(yùn)動(dòng)后24 h的增加水平顯著高于運(yùn)動(dòng)2 h。HMGB1是一種高度保守的核蛋白，也是公認(rèn)的具有重要臨床意義的晚期促炎因子。與細(xì)胞膜RAGE結(jié)合后，HMGB1就會(huì)通過影響胞漿氧還狀態(tài)激活NFκB、MAPK、纖溶酶原激活抑制物、Cdc42與Rac等一系列調(diào)節(jié)因子，從而放大促炎效應(yīng)[12]，HMGB1在運(yùn)動(dòng)應(yīng)答中的重要意義必然會(huì)成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。

4 小結(jié)

長時(shí)間離心運(yùn)動(dòng)中，線粒體ROS生成增多和運(yùn)動(dòng)結(jié)束后延遲性呼吸爆發(fā)可能分別是運(yùn)動(dòng)過程中和運(yùn)動(dòng)結(jié)束后2次NFκB核轉(zhuǎn)入的重要誘因。

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Different Sources of ROS Contribute to NFκB Nuclear Import in Rat Skeletal Muscle During and After EccentricExercise

LIAO Peng1，HE Qinghua2，PENG Haiyan2，Li Feifei2，XING Guilei2，ZHANG Yong3
（1.Dept.of Health and Sport Science，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China；2.Dept.of Postgraduate，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China；3.Institute of Sport Medicine，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China）

Aim：To investigate the contribution of different sources of ROS to NFκB nuclear import in rat skeletal muscle during and after eccentric exercise. Methods：Female SD rats（age 3 mo）were randomly divided into the following five groups（n=6）：ran on the treadmill at 25 m/min，-10%grade for 1（E1h）or 2 h（E2 h）and were killed immediately；ran for 2 h and killed at 6 h（E2 h+6）or 24 h（E2 h+24）after exercise；or killed at rest as controls（C）.Results：The nuclear accumulation of p65 showed progressive increases in muscles during eccentric exercise.This change was accompanied by a progressive decrease of mitochondrial aconitase activity.At 24 h，there were marked increases in H2O2concentration，myleoperoxidase activity，and inflammatory cell infiltration along with nuclear accumulation of p65 in muscle.The serum contents of HMGB1 were significantly elevated during exercise and at 24h after exercise.For muscular target genes of NFκB activation，no significant differences of MnSOD mRNA levels were shown among groups，but the mRNA levels of TNFα in E2h，E2h+6，and E2h+24 were significantly higher than C.Conclusion：Increased mitochondrial O2—.during eccentric exercise and elevated H2O2 during respiratory burst can explain the biphasic nuclear import of NFκB during and after exercise respectively.

redox state；mitochondria；delayed onset muscle damage；respiratory burst；p65

G 804.2

A

1005-0000（2014）04-286-04

2014-04-05；

2014-06-28；錄用日期：2014-06-29

天津市教委科研計(jì)劃一般項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：20080608）；天津體育學(xué)院博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目

廖鵬（1969-），男，山東濟(jì)寧人，博士，副教授，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)氧化應(yīng)激研究。

1.天津體育學(xué)院健康與運(yùn)動(dòng)科學(xué)系，天津 300381；2.天津體育學(xué)院研究生部，天津 300381；3.天津體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300381。