柔嫩艾美耳球蟲G6-PI基因的克隆、序列分析與原核表達(dá)

劉 田，廖申權(quán)，戚南山，吳彩艷，李 娟，呂敏娜，李國清，孫銘飛

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510640；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣州 510640）

柔嫩艾美耳球蟲G6-PI基因的克隆、序列分析與原核表達(dá)

劉 田1,2，廖申權(quán)2，戚南山2，吳彩艷2，李 娟2，呂敏娜2，李國清1，孫銘飛2

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510640；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣州 510640）

為研究柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（glucose- 6-phosphate isomerase, G6-PI）的生化特性，本研究對其基因進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)。根據(jù)NCBI已公布的E. tenellaHoughton株G6-PI的基因序列（GI: 298161921）設(shè)計(jì)特異性引物，運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增EtG6-PI基因序列，并將其克隆到表達(dá)載體pColdI、pCold43a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pColdIEtG6-PI、pCold43a-EtG6-PI，經(jīng)測序鑒定正確后，將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coliRosetta (DE3)，并進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明，E. tenellaG6-PI的ORF序列（1650 bp），編碼550個氨基酸；重組菌pColdI-EtG6-PI、pCold43a-EtG6-PI均能成功誘導(dǎo)表達(dá)，其中pCold43a-EtG6-PI表達(dá)部分可溶性蛋白，表達(dá)產(chǎn)物純化后可用于酶生化特性分析。柔嫩艾美耳球蟲G6-PI基因的成功克隆表達(dá)為該酶的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

柔嫩艾美耳球蟲；葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶；克??；原核表達(dá)

雞球蟲病是由一種或幾種艾美耳球蟲感染引起的以腸道病變?yōu)橹鞯募纳x病，嚴(yán)重危害集約化養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，每年因此造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)25億英鎊以上[1]。柔嫩艾美耳球蟲（E. tenella）是致病力最強(qiáng)的病原之一，可引起雛雞血便，食欲減退，蛋雞產(chǎn)蛋下降等癥狀。目前雞球蟲病的防控仍然是以藥物預(yù)防為主，但雞球蟲廣泛而嚴(yán)重的抗藥性極大影響了球蟲藥的防治效果，生產(chǎn)上迫切需要新型抗球蟲藥物。近年來，基于藥物靶標(biāo)的藥物篩選已成為當(dāng)今藥研發(fā)的主流方法，藥物靶標(biāo)的功能解析成為研制新型藥物最為重要的一環(huán)。

葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（glucose-6-phosphate isomerase，G6-PI）在糖酵解過程中催化葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣?6-磷酸的可逆反應(yīng)，參與球蟲的能量代謝過程，對球蟲的生存起著重要作用。2003年，Readmond等[2]利用RNAi技術(shù)研究布氏錐蟲（Trypanosoma brucei）葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶，發(fā)現(xiàn)G6-PI的下調(diào)使得T. brucei的生長受到50%抑制。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，T. brucei及墨西哥利什曼原蟲（Leishmania mexicana）G6-PI的高級結(jié)構(gòu)[3-5]已經(jīng)解析，基于該酶結(jié)構(gòu)特征開展了一系列的抑制物篩選工作，結(jié)果顯示，葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶是抗頂復(fù)門原蟲藥物研發(fā)的潛在靶標(biāo)[6]。目前，僅在NCBI數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)注釋的EtG6-PI基因序列，未見相關(guān)的研究報(bào)道。本研究旨在對EtG6-PI基因進(jìn)行克隆、序列分析及重組表達(dá)，為系統(tǒng)研究EtG6-PI的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物及飼料 1日齡嶺南黃肉雞，購自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所種雞場；全價肉仔雞飼料（不含抗球蟲藥和抗菌藥）。

1.1.2 蟲株、載體及菌株E. tenella（廣東株）卵囊為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所寄生生物室分離保存；pMD18-T 載體購自寶生物（大連）有限公司；表達(dá)載體pColdI、E. coliDH 5α、E. coliRosetta（DE3）株由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所寄生生物室保存；pCold43a表達(dá)載體由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茅翔教授饋贈。

1.1.3 試劑與試劑盒 氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、IPTG、SDS、DMSO、EDTA、DTT、Tris、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-βd-thiogalactoside）等購自上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司；DNA Marker （DL2000/DL4500）為天根生物技術(shù)有限公司；胰酶（trypsin）為Hyclone公司產(chǎn)品；E.Z.N.A質(zhì)粒小量制備試劑盒和DNA膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；LATaqTM、瓊脂糖、RTPCR試劑盒為寶生物工程（大連)有限公司產(chǎn)品；PreMixTaqEx為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；試驗(yàn)中所需的現(xiàn)配溶液，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》配制[7]。

1.1.4 引物 根據(jù)NCBI已公布的EtG6-PI cDNA序列（GI∶ 298161921），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2對引物，由上海英俊生物工程公司合成。上游引物（EtG6-PI F）∶ 5'-GCGGAATTCATGTCTTCT CAGTTCGCCGCCT-3'；下游引物（EtG6-PI R）∶5'-GCGGTCGACTTAGGCAGATAAATACTTCTGC AGT-3'；含EcoRI酶切位點(diǎn)（下劃線）上游引物F∶5'-CCGGAATTCGCGGAATTCATGTCTTCTCAGTT CGCCGCCT-3'；含SalI酶切位點(diǎn)（下劃線）下游引物R：5'-CCCGTCGACGCGGTCGACTTAGGCAGA TAAATACTTCTGCAGT-3'

1.2 方法

1.2.1 E. tenella第二代裂殖子的分離及純化 參照文獻(xiàn) [8]的方法進(jìn)行E. tenella第二代裂殖子的分離及純化。2周齡無球蟲感染雞每只口服20×104孢子化卵囊，感染后第112 h撲殺取盲腸，剖開腸腔，棄腸內(nèi)容物用PBS洗滌3次，再用刀背輕刮取腸黏膜，以含2.5 g/L胰酶和7.5 g/L 脫氧膽酸鈉的PBS 緩沖液于40℃消化30 min，紗布過濾去除組織碎片后，濾液加PBS 緩沖液，1000×g離心10 min，重復(fù)2次，所得沉淀即為純化的裂殖子。

1.2.2 E. tenella第二代裂殖子總RNA的提取 參照Invitrogen 公司的TRIzol LS?Reagent 試劑盒說明書。

1.2.3 EtG6-PI基因的RT-PCR擴(kuò)增 以上述提取的總RNA為模板，用TaKaRa公司Prime ScriptTM1st Strand synthesis Kit 試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板，EtG6-PI F、EtG6-PI R為引物，用LATaqTM酶擴(kuò)增EtG6-PI。PCR條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性 30 s；60℃ 退火30 s；72℃延伸2 min；35個循環(huán)；72℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物按試劑盒回收并連接到pMD18-T載體上，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E. coliDH 5α感受態(tài)細(xì)胞中，菌液PCR鑒定陽性菌落，陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司測序分析。

1.2.4 EtG6-PI基因序列分析 利用在線工具Translate tool（http://www.expasy.ch/tools/dna.htmL）翻譯EtG6-PI序列，對氨基酸序列用SignalP 3.0 （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線軟件進(jìn)行信號肽序列分析，利用TargetP 1.1 server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）在線分析軟件對EtG6-PI進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；利用在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對EtG6-PI 的氨基酸序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析。根據(jù)PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/）與EtG6-PI三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫已知的蛋白質(zhì)分子模板，利用晶體結(jié)構(gòu)最為相似原理（http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.phpfunc=modelling_simple1）對EtG6-PI進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) 以E. coliDH 5α（pMD18-T-EtG6-PI）為模板，含EcoRI酶切位點(diǎn)上游引物F，含SalI酶切位點(diǎn)下游引物R為引物，擴(kuò)增含EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)的EtG6-PI片段，分別用EcoRI和SalI雙酶切pCold I/pCold 43a質(zhì)粒和EtG6-PI片段，膠回收試劑盒回收EtG6-PI片段和pCold I/pCold 43a酶切片段。目的片段與載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coliDH 5α，菌液PCR鑒定陽性菌落，陽性樣品送北京六合華大基因科技股份有限公司測序分析。選取測序正確的pColdI-EtG6-PI、pCold43a-EtG6-PI克隆，37℃培養(yǎng)過夜，按試劑盒分別提取重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒pColdI-EtG6-PI、pCold43a-EtG6-PI分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E. coliRosetta (DE3)，菌液PCR鑒定陽性克隆，陽性菌落在10 mL（Amp 100 μg/mL）LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，按1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)于LB（含Amp）培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加入1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。離心棄上清收集菌體，將菌體重懸于PBS溶液中，冰浴超聲破碎，10 800×g離心20 min，超聲破碎后上清及沉淀分別用SDS-PAGE分析重組蛋白在菌體中的分布。

2 結(jié)果

2.1 EtG6-PI基因的RT-PCR擴(kuò)增利用TRIzol方法提取第二代裂殖子總RNA，根據(jù)NCBI已公布的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以第二代裂殖子總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，在1700 bp處有特異性目的條帶，與預(yù)期片段大小一致（見圖1）；將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR鑒定陽性克隆，陽性克隆菌送北京六合華大基因科技股份有限公司測序分析。

圖1 EtG6-PI序列擴(kuò)增結(jié)果及菌液PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR product of EtG6-PI and identif cation of its positive clone

2.2 EtG6-PI基因分析

2.2.1 序列分析 測序分析發(fā)現(xiàn)EtG6-PI全長編碼序列1650 bp，利用clustalW2比對分析發(fā)現(xiàn)，與NCBI數(shù)據(jù)庫注釋的序列大小一致，相似性高達(dá)99%（見圖2）。

2.2.2 EtG6-PI亞細(xì)胞定位、信號肽分析 利用SignalP 3.0和TargetP 1.1 server在線軟件對EtG6-PI進(jìn)行信號肽序列分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示EtG6-PI無信號肽，且準(zhǔn)確系數(shù)為2。

2.2.3EtG6-PI跨膜結(jié)構(gòu)域分析 對EtG6-PI的氨基酸序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域（見圖3）。

圖2 EtG6-PI擴(kuò)增序列與注釋序列的比對分析結(jié)果Fig.2 Alignment of the amplif ed fragment of EtG6-PI with the predicted sequence

圖3 EtG6-PI跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Prediction of transmembrane helices in EtG6-PI

2.2.4EtG6-PI三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示EtG6-PI單體由27個α螺旋，12個β折疊構(gòu)成（見圖4）

圖4 EtG6-PI三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 The predicted tertiary structure of EtG6-PI

2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定對EtG6-PI（含EcoRI、SalI酶切位點(diǎn)）片段和pColdI/pCold43a空質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，連接、轉(zhuǎn)化、PCR鑒定，成功獲得pColdIEtG6-PI、pCold43a-EtG6-PI重組質(zhì)粒；用EcoRI和SalI對pColdI-EtG6-PI、pCold43a-EtG6-PI重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，獲得大小約1700 bp片段，與預(yù)測大小相符。

2.4 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)將帶有pColdIEtG6-PI、pCold43a-EtG6-PI重組質(zhì)粒的E.coliRosetta (DE3)菌液，擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)IPTG于22℃誘導(dǎo)表達(dá)，離心菌液，PBS重懸菌體，冰浴超聲破碎后分別取上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。pCold I-EtG6-PI融合表達(dá)蛋白大小約為61.4 kDa，超聲裂解后，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，重組蛋白以包涵體形式存在（見圖5）；pCold43a-EtG6-PI融合表達(dá)蛋白大小約為113.4 kDa（pCold 43a載體蛋白大小為52 kDa），超聲裂解后，SDS-PAGE分析，蛋白表達(dá)量較pCold I-EtG6-PI少，但重組蛋白部分可溶（見圖6），可溶性蛋白純化后可用于酶生化特性分析。

圖5 pColdI-EtG6-PI表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the expression product of pColdI-EtG6-PI

圖6 pCold43a-EtG6-PI表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of the expression product of pCold43a-EtG6-PI

3 討論

葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶具有多種生物學(xué)功能，主要參與糖代謝的糖酵解作用，糖代謝是生物體獲取能量的主要方式。糖酵解過程在有氧或無氧條件下均可進(jìn)行，是所有生物體進(jìn)行葡萄糖分解代謝所必須的共同路徑。寄生性原蟲的生長發(fā)育需要獲取能量，而直接提供能量的物質(zhì)是ATP。機(jī)體生命活動的能量獲取的主要途徑為糖酵解途徑，三羧酸循環(huán)及磷酸戊糖途徑。研究表明，頂復(fù)門原蟲在其發(fā)育過程中，大多數(shù)內(nèi)生發(fā)育階段為低氧或無氧的環(huán)境，使得其代謝方式與細(xì)菌有許多共同之處，并且不遵循“pasteur effect”（巴斯德效應(yīng)），即在有氧條件下頂復(fù)門原蟲仍主要依靠糖酵解途徑獲取能量[9-11]。這一重要特征決定了糖酵解途徑的一些關(guān)鍵酶可以作為開發(fā)新型抗頂復(fù)門原蟲藥物的靶標(biāo)。因而近年來頂復(fù)門原蟲的糖酵解生化代謝途徑成為研究的熱點(diǎn)。

1994年，Nyame等[12]成功克隆了Leishmania. mexicanaG6-PI基因，亞基分子量為65 kDa，與惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）G6-PI基因序列大小一致，編碼604個氨基酸，超過90%存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，少量存在于糖酵解酶體。隨后，Concepcion等[13]研究發(fā)現(xiàn)枯氏錐蟲（Trypanosoma cruzi）G6-PI亞基分子量為63 kDa，約60%存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，40%存在于糖酵解酶體，蛋白以三聚體形式存在。Marchand等[14]研究表明T. bruceiG6-PI存在于糖酵解酶體，且等電點(diǎn)較低。2004年，Cordeiro等[4]對L. mexicanaG6-PI進(jìn)行了蛋白結(jié)晶及X射線衍射分析，解析了LmG6-PI結(jié)構(gòu)信息，為EtG6-PI的功能研究提供了可供借鑒的資料。

本研究克隆了柔嫩艾美耳球蟲G6-PI基因，并在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。原核表達(dá)系統(tǒng)具有高效、快捷、成本低及周期短等特點(diǎn)，被廣泛地用于外源蛋白的重組表達(dá)。本試驗(yàn)最初構(gòu)建的重組質(zhì)粒pColdI-EtG6-PI，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后未獲得可溶性蛋白，隨后選擇pCold43a作為表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)pCold43a-EtG6-PI的蛋白表達(dá)量雖然有所降低，但獲得了可溶性重組蛋白，滿足后期試驗(yàn)需求。pCold43a表達(dá)載體帶有NusA融合標(biāo)簽，在低溫條件下有利于融合蛋白的表達(dá)，在一定程度上增加了表達(dá)蛋白的可溶性。本研究所獲得的帶NusA融合標(biāo)簽的可溶性蛋白，將用于EtG6-PI的生化特性分析，為EtG6-PI的功能研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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CLONING, SEQUENCE ANALYSIS AND PROKARYOTIC EXPRESSION OF GLUCOSE-6-PHOSPHATE ISOMERASE OF EIMERIA TENELLA

LIU Tian1,2, LIAO Shen-quan2, QI Nan-shan2, WU Cai-yan2, LI Juan2, LV Min-na2, LI Guo-qing1, SUN Ming-fei2
(1.College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510640, China; 2.Institute for Animal Health, Guangdong Academy Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China)

In order to analyze biochemical properties ofEimeria tenellaglucose-6- phosphate isomeraseEtG6-PI, the full-length of open reading frameEtg6-PI was amplif ed in RT-PCR from total RNA from the second-generation schizonts ofE. tenella. The amplif ed fragments were Results showed that the open reading frame was 1650 bp, sequenced. TheEtg6-PI gene was cloned into the expression vectors pColdI and pCold43a and expressed inE. coliRosetta (DE3). encoded a protein of 550 amino acids. The recombinant vectors pColdI-EtG6-PI or pCold43a-EtG6-PI was transformed intoE. coliRosetta (DE3) cells and the expression was induced with IPTG Soluble protein obtained from pCold43a-EtG6-PI purif de by the aff nity chromatography assay can be used for biochemical analysis of this enzyme. The prokaryotic expression ofE. tenellaG6-PI set important basis for function study on glucose-6-phosphate isomerase.

Eimeria tenella; glucose-6-phosphate isomerase; cloning; prokaryotic expression

S852.723

A

1674-6422（2014）02-0072-06

2014-01-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (31201902；31302087)；珠江科技新星項(xiàng)目(2012J2200059)；廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)支撐項(xiàng)目（2012A061100006）；廣東省對外科技合作項(xiàng)目（2011B050700007）

劉田，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

李國清， E-mail：gqli@scau.edu.cn；孫銘飛， E-mail：smf7810@gmail.com