RNA干擾HIF-1α對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的VEGF表達(dá)及增殖的影響

陳勇 彭勇 于靜雅 鄔秀娣 羅晶 張振 干敏芝 黃嫻倩 章海均

RNA干擾HIF-1α對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的VEGF表達(dá)及增殖的影響

陳勇 彭勇 于靜雅 鄔秀娣 羅晶 張振 干敏芝 黃嫻倩 章海均

目的 探討shRNA特異性干擾沉默缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)及其增殖的影響。方法獲取9例RA患者滑膜組織進(jìn)行RA-FLS的分離培養(yǎng)及傳代。將FLS分為4組：常氧組、缺氧組、陰性質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒）和陽性質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染HIF-1α陽性質(zhì)粒），常氧組進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，后3組進(jìn)行缺氧培養(yǎng)12h；采用Western blot和qRT-PCR法分別檢測(cè)各組FLS中HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)情況。將缺氧組、陰性質(zhì)粒組和陽性質(zhì)粒組的FLS分別于缺氧條件下培養(yǎng)6、12、24、48h，應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。結(jié)果與常氧組相比，缺氧組FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05），而陰性質(zhì)粒組和缺氧組FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)水平無明顯差異（P＞0．05）；陽性質(zhì)粒組FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA較缺氧組下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。4組FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0．01）。缺氧培養(yǎng)12h后陽性質(zhì)粒組的FLS生長(zhǎng)較缺氧對(duì)照組及陰性質(zhì)粒組減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），而后兩組FLS生長(zhǎng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。結(jié)論RNA干擾HIF-1α表達(dá)能有效下調(diào)RA-FLS中HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA水平，并且能抑制FLS的異常增殖。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 成纖維樣滑膜細(xì)胞 RNA干擾 細(xì)胞增殖 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種常見的以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征，以慢性、進(jìn)行性、侵襲性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病，是造成我國(guó)人群致殘的主要原因之一。目前對(duì)于RA的發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚，其基本病理表現(xiàn)為滑膜炎和血管翳的形成。早在上世紀(jì)80年代Fassbender等[1]發(fā)現(xiàn)RA成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）具有類腫瘤生長(zhǎng)特性，而近年來的研究發(fā)現(xiàn)RA-FLS類似腫瘤細(xì)胞樣的生物學(xué)特性表現(xiàn)為FLS的異常增殖、遷移和浸潤(rùn)及抗凋亡[2]。而RA的滑膜炎就主要表現(xiàn)為滑膜異常增生、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及炎癥因子的釋放，這些又將引起關(guān)節(jié)微環(huán)境的缺氧[3]，體內(nèi)細(xì)胞缺氧反應(yīng)的核心調(diào)節(jié)因子是缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）[4]。血管翳的形成是RA的另一重要病理表現(xiàn)，也是RA發(fā)生、發(fā)展過程的中心環(huán)節(jié)，主要表現(xiàn)為新生血管的形成。而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一種較強(qiáng)的刺激血管新生的因子，在血管新生中起著核心的作用；關(guān)節(jié)微環(huán)境的缺氧就是VEGF表達(dá)的主要誘導(dǎo)因素之一。我們前期研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下RA患者滑膜細(xì)胞的HIF-1α及VEGF表達(dá)水平較骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）患者顯著升高，且兩者水平呈密切相關(guān)[5]。因此，筆者推測(cè)“缺氧-HIF-1α-VEGF”這一信號(hào)途徑在RA的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，而HIF-1α又在其中起著核心作用。因此，本研究擬通過體外應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性靶向抑制RA-FLS的HIF-1α基因，探討缺氧條件下其對(duì)RA-FLS的VEGF表達(dá)及增殖的影響，從而為RA的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 選取2012-03—2013-05寧波市第二醫(yī)院及寧波市第六醫(yī)院行關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者的滑膜組織9例（寧波市第二醫(yī)院6例，寧波市第六醫(yī)院3例），其中男2例，女7例，年齡42～64歲，平均（54.3±10.5）歲。診斷符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟（ACR/EULAR）的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)[6]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)兩家醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，術(shù)前獲患者同意并簽署知情同意書。獲取滑膜組織后將其保存于無血清的DMEM培養(yǎng)基中，2h內(nèi)冰盒運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2 主要試劑 眼科剪；眼科鑷；細(xì)胞培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶（美國(guó)NUNC公司）；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS）（美國(guó)Hyclone/Thermo Scientific公司）；Tris-HCl緩沖液（TBS）及含0.2%吐溫的TBS緩沖液（TBST）、總蛋白提取試劑盒（上海索萊寶公司）；HIF-1α-shRNA重組質(zhì)粒、質(zhì)粒提取試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑Effectene Transfection Reagent（德國(guó)Qiagen公司）；BCA蛋白定量試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；兔抗人HIF-1α多克隆抗體（一抗，美國(guó)Cell Signaling公司）；兔抗人VEGF多克隆抗體（一抗，美國(guó)Canta Cruz公司）；兔抗人β-actin單抗（一抗）及鼠抗兔二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Western Bright Quantum增強(qiáng)型發(fā)光底物（APG BIO環(huán)亞生物科技有限公司）；總RNA提取劑（日本Takara公司）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR檢測(cè)試劑盒、MTT試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）。

1.3 方法

1.3.1 滑膜細(xì)胞培養(yǎng) 在生物安全柜內(nèi)無菌條件下，用眼科剪和鑷去除滑膜組織塊表面血污及脂肪組織，PBS緩沖液清洗2遍。將組織塊轉(zhuǎn)移至新的盛有DMEM培養(yǎng)基（含抗生素）的培養(yǎng)皿內(nèi)，將滑膜組織塊剪成1mm3；用槍頭將組織塊擺放至25cm2的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，組織間隔1cm，將培養(yǎng)瓶倒置（組織塊面朝上）于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。孵育4h后向瓶?jī)?nèi)加入5ml DMEM培養(yǎng)基 (含15%FBS和青、鏈霉素)，然后將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)讓培養(yǎng)基浸沒組織塊，置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24h后換液，以后每隔2～3d換液。培養(yǎng)期間偶有組織塊離壁、漂浮，即時(shí)換液去除漂浮組織塊。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至90%，1∶2常規(guī)消化傳代。實(shí)驗(yàn)所用RA-FLS均采用第3～5代細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HIF-1α-shRNA（攜帶綠色銀光蛋白，GFP）重組質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增和提取。將滑膜細(xì)胞分為常氧組、缺氧組、陽性質(zhì)粒組和陰性質(zhì)粒組；常氧組和缺氧組未處理，常氧組作為空白對(duì)照；陽性質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染HIF-1α-shRNA陽性質(zhì)粒，陰性質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒（即無關(guān)序列組）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參考Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒并做條件優(yōu)化處理，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率并取最佳優(yōu)化條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4～6h后對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行換液，繼續(xù)常規(guī)條件下培養(yǎng)24h后。然后將常氧組繼續(xù)常氧條件下培養(yǎng)12h，其余3組轉(zhuǎn)移至缺氧條件下（1%O2）培養(yǎng)12h。

1.3.3 Western blot檢測(cè)HIF-1α及VEGF的表達(dá) 分別收集上述4組滑膜細(xì)胞并提取各組細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取30μg總蛋白進(jìn)行蛋白電泳：分離膠恒壓80V 20min，濃縮膠恒壓100V 90min；轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜前將濾紙于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡20min，恒流41 mA半干轉(zhuǎn)2h，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上；封閉：將膜置于5%BSA封閉液中封閉1h，采用TBST洗膜2次，10min/次，TBS洗膜1次，10min；加待測(cè)的相應(yīng)目的蛋白的一抗（抗HIF-1α或抗VEGF抗體），4℃過夜孵育，同上洗膜；加二抗，室溫孵育1h，同上洗膜。ECL發(fā)光劑發(fā)光，Tanon-4200 SF全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像儀中，CCD曝光成像。凝膠圖像分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行吸光度掃描，以βactin做內(nèi)參進(jìn)行校正，以HIF-1α和VEGF蛋白條帶的吸光度值比上各自β-actin的吸光度值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）HIF-1α及VEGF mRNA表達(dá) 分別收集上述4組滑膜細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度。取2μg上述總RNA在MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下將其合成cDNA。采用qRT-PCR法檢測(cè)4組滑膜細(xì)胞HIF-1α和VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的基因核苷酸序列，采用分子生物學(xué)軟件Primer5進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)，將設(shè)計(jì)好的引物送上海生物工程有限公司合成。引物序列：HIF-1α上游引物：TTGCTCATCAGTTGCCACTTCC，HIF-1α下游引物：AGCAATTCATCTGTGCTTTCATGTC，產(chǎn)物長(zhǎng)度153bp。VEGF上游引物：AAGGAGGAGGGCGAGAATCAT。VEGF下游引物：GCAGTAGCTGCGCTGATAGA，產(chǎn)物長(zhǎng)度 66bp。設(shè)GAPDH為內(nèi)參基因，上游引物：GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC，GAPDH下游引物：AATGAAGGGGTCATTGATGG，產(chǎn)物長(zhǎng)度110bp。根據(jù)qRT-PCR試劑盒操作，反應(yīng)體系為25μl，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。qRTPCR反應(yīng)條件為：95℃4min預(yù)變性；95℃15s變性，65℃30s退火，72℃30s延伸，共40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR檢測(cè)CT值，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析，△△Ct=實(shí)驗(yàn)組基因△Ct值-對(duì)照組基因△Ct值，△Ct=目的基因△Ct-內(nèi)參基因△Ct值。

1.3.5 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 將滑膜細(xì)胞分為缺氧組、陽性質(zhì)粒組和陰性質(zhì)粒組，取1×104個(gè)/孔分別接種于96孔培養(yǎng)板，并設(shè)空白調(diào)零孔，缺氧組為對(duì)照組，培養(yǎng)12h貼壁。其余組同上進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，每組做5個(gè)復(fù)孔，于缺氧條件下分別培養(yǎng)6、12、24、48h。向各孔加入0.5mg/ml的MTT試劑20μl，37℃反應(yīng)4h后棄去孔內(nèi)液體；加入二甲基亞砜200μl終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值（A）。以A值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法；兩組間比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Person相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染shRNA后對(duì)RA-FLS中HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響 通過熒光顯微鏡可觀察到轉(zhuǎn)染后細(xì)胞表達(dá)shRNA質(zhì)粒攜帶的綠色熒光蛋白，詳見圖1。

圖1 HIF-1α-shRNA轉(zhuǎn)染前后FLS（A：轉(zhuǎn)染前普通光鏡下RA-FLS；B：轉(zhuǎn)然后熒光顯微鏡下RA-FLS表達(dá)綠色熒光蛋白；倒置顯微鏡，×40）

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，缺氧組的HIF-1α和VEGF表達(dá)較常氧組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與陰性質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HIF-1α和VEGF表達(dá)較缺氧組下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)常氧組兩種蛋白幾乎不表達(dá)，詳見圖2。

2.2 轉(zhuǎn)染shRNA后對(duì)RA-FLS中HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)水平的影響 缺氧組的HIF-1α和VEGF mRNA與常氧組相比表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與陰性質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而陽性質(zhì)粒組的HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)較缺氧組水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)常氧組的HIF-1α和VEGF mRNA幾乎不表達(dá)，詳見圖3。GAPDH內(nèi)參、HIF-1α和VEGF的qRT-PCR產(chǎn)物的溶解均呈單峰，說明實(shí)驗(yàn)特異性較高、結(jié)果可靠。

2.3 RA-FLS中HIF-1α和VEGF表達(dá)水平的相關(guān)分析 通過對(duì)常氧組、缺氧組、陰性質(zhì)粒組和陽性質(zhì)粒組FLS中HIF-1α及VEGF表達(dá)情況進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明兩者表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.89，P＜0.01），詳見圖4。同時(shí)對(duì)上述4組FLS中HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)情況進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明兩者表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.79，P＜0.01），詳見圖5。

圖2 各組FLS中HIF-1α和VEGF表達(dá)（與常氧組相比，*P＜0.05；與缺氧組相比，#P＜0.05）

圖3 各組FLS中HIF-1α和VEGF mRNA的表達(dá)（與常氧組相比，*P＜0.05；與缺氧組相比，#P＜0.05）

圖4 HIF-1α和VEGF表達(dá)水平相關(guān)關(guān)系

2.4 轉(zhuǎn)染shRNA后對(duì)RA-FLS增殖的影響 MTT法檢測(cè)缺氧組、陰性質(zhì)粒組和陽性質(zhì)粒組滑膜細(xì)胞缺氧不同時(shí)間后的增殖情況發(fā)現(xiàn)，從缺氧12h開始陽性質(zhì)粒組的滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)較缺氧對(duì)照組和陰性質(zhì)粒組明顯減慢，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；而后兩組滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)速度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，詳見圖6。

圖5 HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)水平相關(guān)關(guān)系

圖6 HIF-1αshRNA干擾對(duì)缺氧條件下RA-FLS增殖的影響

3 討論

RA最大的危害在于其致殘性，即可導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)破壞和畸形。目前有大量研究都認(rèn)為活化的RA-FLS在RA的發(fā)生、發(fā)展過程中起至關(guān)重要的作用，其具有類腫瘤生長(zhǎng)特性即侵蝕性，是RA患者關(guān)節(jié)軟骨與骨破壞的主要參與者[7-8]，而滑膜炎和血管翳的形成是RA的基本病理表現(xiàn)。RA關(guān)節(jié)滑膜炎主要表現(xiàn)在炎癥關(guān)節(jié)中的大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥因子的產(chǎn)生及滑膜細(xì)胞的異常增生，而這些都將導(dǎo)致RA關(guān)節(jié)微環(huán)境的缺氧，從而誘導(dǎo)滑膜組織的HIF-1α高表達(dá)。目前研究已經(jīng)證實(shí)，RA受累關(guān)節(jié)微環(huán)境中存在缺氧[9]。而Brouwer等[10]研究也發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜組織的HIF-1α表達(dá)水平顯著高于OA患者滑膜組織，還發(fā)現(xiàn)RA滑膜組織HIF-1α陽性細(xì)胞數(shù)與其血管數(shù)目、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)及滑膜炎癥得分成正相關(guān)。國(guó)內(nèi)學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，早期活動(dòng)組RA患者的血清HIF-1α要顯著高于OA患者組及健康對(duì)照組，并且高于中晚期活動(dòng)組及穩(wěn)定組RA患者[11]。血管翳的形成則是RA發(fā)生、發(fā)展過程的中心環(huán)節(jié)，主要表現(xiàn)為新生血管的形成。Ozgonenel等[12]發(fā)現(xiàn)RA患者的血清和滑液中VEGF水平顯著升高，并且VEGF水平與疾病的活動(dòng)有關(guān)。而關(guān)節(jié)微環(huán)境的缺氧是VEGF及其受體表達(dá)的主要誘導(dǎo)因素之一。近年來一些針對(duì)缺氧核心調(diào)節(jié)因子HIF-1α的抑制劑被也證明對(duì)炎癥性關(guān)節(jié)有效，如Shankar等[13]應(yīng)用二苯甲酮類似物（BP-1）處理佐劑誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（AIA）大鼠模型后，BP-1可下調(diào)早期關(guān)節(jié)炎大鼠VEGF和HIF-1α的表達(dá)，同時(shí)可減輕關(guān)節(jié)癥狀。Chou等[14]報(bào)道向AIA大鼠模型關(guān)節(jié)中注入透明質(zhì)酸可以抑制其HIF-1α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、MMP-3的表達(dá)同時(shí)還可減輕關(guān)節(jié)疼痛。這些都表明HIF-1α可能參與了RA的發(fā)病過程，并且起著重要作用。

本研究通過對(duì)RA滑膜組織的成纖維樣滑膜細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，并應(yīng)用shRNA對(duì)其HIF-1α基因進(jìn)行特異性干擾，檢測(cè)常氧和缺氧條件下HIF-1α shRNA對(duì)RA滑膜細(xì)胞的HIF-1α和VEGF蛋白及其mRNA表達(dá)，同時(shí)觀察其對(duì)滑膜細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，缺氧組的RA滑膜細(xì)胞HIF-1α和VEGF及其mRNA表達(dá)水平要顯著高于常氧組，而兩者在常氧條件下幾乎不表達(dá)；通過HIF-1α shRNA干擾后發(fā)現(xiàn)陽性質(zhì)粒組滑膜細(xì)胞的HIF-1α和VEGF及其mRNA水平較缺氧組對(duì)照組有所下調(diào)，并且通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)HIF-1α和VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)。這表明RA炎癥關(guān)節(jié)微環(huán)境的缺氧可以通過上調(diào)HIF-1α表達(dá)從而誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞表達(dá)VEGF，進(jìn)而可能加劇滑膜炎癥。通過干擾抑制滑膜細(xì)胞不僅可以下調(diào)VEGF的表達(dá)，本研究還發(fā)現(xiàn)陽性質(zhì)粒組的滑膜細(xì)胞與對(duì)照組相比生長(zhǎng)受到抑制。這表明下調(diào)滑膜細(xì)胞的HIF-1α表達(dá)可能可以延緩滑膜炎癥并且抑制滑膜細(xì)胞的異常增殖從而達(dá)到控制和治療疾病的目的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)缺氧培養(yǎng)條件下RA-FLS中HIF-1α和VEGF的表達(dá)升高，而通過HIF-1α-shRNA體外特異性抑制RA-FLS的HIF-1α表達(dá)，不僅可以抑制FLS的HIF-1α的表達(dá)從而下調(diào)RA血管新生的核心調(diào)節(jié)因子-VEGF，并且可以抑制缺氧條件下RA-FLS的異常增殖，提示以HIF-1α為靶向的RNA干擾治療RA的有效性。我們進(jìn)一步擬應(yīng)用病毒載體轉(zhuǎn)染HIF-1α shRNA，在RA動(dòng)物模型中進(jìn)一步明確RNA干擾HIF-1α的有效性和安全性，為臨床治療RA提供新的策略和依據(jù)。

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Effects of shRNA-HIF-1α-mediated gene silencing on VEGF expression and proliferation of fibroblast-like synoviocytes in patients with rheumatoid arthritis

Objective To investigate the effects of shRNA-HIF-1α-mediated gene silencing on VEGF expression and proliferation of fibroblast-like synoviocytes (FLS)in patients with rheumatoid arthritis in vitro．MethodsThe fibroblast-like synoviocytes were isolated and cultured from synovial tissue of 9 patients with rheumatoid arthritis．The cultured FLSs were divided into 4 groups:hypoxic group,normoxic group,the negative control group (transfected with blank plasmids)and the positive group (transfected with HIF-1α-shRNA)．The cells in normoxic group were incubated under normoxia,and cells in other three groups were incubated under hypoxia．The expression of HIF-1α and VEGF protein and mRNA were detected by Western blot and qRT-PCR,respectively．The cells in hypoxia,negative control and positive groups were incubated under hypoxia for 6,12,24 and 48 hours．The proliferation of RA-FLS was examined by MTT．ResultsHigher expressions of HIF-1α and VEGF protein and mRNA were detected in hypoxic group compared with those in normoxia group (P＜0．05)．There were no significant differences in protein and mRNA expression of HIF-1α and VEGF between normoxic group and negative control group (P＞0．05)．Compared with the normoxic group and the negative control group,the expression of HIF-1α and VEGF protein and mRNA in positive group were significantly lower(P＜0．05)．The expression of HIF-1α were positively correlated with VEGF in all 4 groups (P＜0．05)．MTT assays showed that the FLS proliferation in positive group were slower than that in normoxic and negative control groups(P＜0．05)．ConclusionThe plasmids of HIF-1α-shRNA can inhibit HIF-1α and VEGF expression and cell proliferationsof fibroblast-like synoviocytes in patients with rheumatoid arthritis．

Rheumatoid arthritis Fibroblast-like synoviocytes RNA interfering Cell proliferation Hypoxia-inducible factor-1α Vascular endothelial growth factor

2014-03-17）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

寧波市社會(huì)發(fā)展科研項(xiàng)目基金資助（2012C50010）；寧波市自然基金項(xiàng)目（2013A610259）

315010 寧波市第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科（陳勇、彭勇、于靜雅、鄔秀娣、張振、干敏芝、黃嫻倩、章海均）；寧波市第六醫(yī)院風(fēng)濕免疫科（羅晶）

陳勇，E-mail：nbdeyycy@163.com