LAMA4基因?qū)戆┘毎鲋澈颓忠u的調(diào)控機制

鄔振華 李群 龔朝暉 沈志森

LAMA4基因?qū)戆┘毎鲋澈颓忠u的調(diào)控機制

鄔振華 李群 龔朝暉 沈志森

目的 構(gòu)建層粘連蛋白α4亞基（LAMA4）的過表達和干擾序列重組慢病毒，觀察其對Hep-2喉癌細胞株增值和侵襲的調(diào)控機制。方法 全基因合成LAMA4序列并篩選有效的LAMA4基因干擾序列，重組入帶有綠色熒光蛋白慢病毒載體。采用慢病毒感染喉癌細胞株Hep-2后，通過Western blot檢測過表達和干擾效率。MTT法檢測LAMA4基因表達變化時Hep-2細胞株增殖能力的變化。Transwell實驗檢測喉癌細胞株感染前后侵襲能力的變化。利用Western blot和Real-time PCR檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)與膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP)的基因表達量變化情況。結(jié)果 （1）攜帶LAMA4基因片段和小干擾片段的重組慢病毒成功構(gòu)建，包裝慢病毒后濃縮病毒懸液滴度達到5×105TU/μl。（2）基因沉默組LAMA4蛋白相對表達量明顯低于對照組，過表達組相對表達量明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0．05）。（3）LAMA4干擾慢病毒感染Hep-2喉癌細胞株后，細胞株增殖無明顯變化。（4）Transwell小室檢測發(fā)現(xiàn)，基因沉默組及過表達組Transwell細胞數(shù)與對照組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0．05）。（5）與對照組比較，基因沉默組及過表達組MMP-2及MT1-MMP基因與蛋白表達均發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0．05）。結(jié)論 LAMA4基因可能是通過MMP-2和MT1-MMP基因相關(guān)通路調(diào)節(jié)喉癌細胞的侵襲能力，LAMA4可以作為治療喉癌轉(zhuǎn)移的潛在靶點。

基因 喉癌 慢病毒 侵襲能力 增殖

喉癌是耳鼻喉-頭頸外科常見的惡性腫瘤之一，發(fā) 生率約占全身惡性腫瘤的5%，在我國的發(fā)病率呈上升趨勢[1]。喉癌患者5年內(nèi)死亡的主要原因之一為腫瘤的侵潤和轉(zhuǎn)移，而腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移機制已成為目前全球研究的熱點。喉癌作為頭頸外科的多發(fā)病，其發(fā)生、發(fā)展涉及多中心、多環(huán)節(jié)、多通路，分子生物學(xué)機制尚未明確。隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，喉癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制研究逐漸受到重視[2-3]。層粘連蛋白（Laminin，LN）是構(gòu)成基底膜的重要成分之一，有研究證實，LN在高分化喉癌組織中表達水平顯著低于低分化及中分化喉癌，并且和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力相關(guān)[4]。LNα4亞基（Laminin A1-pha4，LAMA4）是LN的重要功能型亞基，是細胞外基質(zhì)中與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的一種功能性基因。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移包括細胞黏附、細胞外基質(zhì)降解、細胞移動等步驟，LAMA4基因被證明在此過程中發(fā)揮了重要作用[5]。本研究擬通過構(gòu)建重組慢病毒使LAMA4基因表達量發(fā)生變化，在過表達和沉默LAMA4基因后，觀察喉癌細胞增殖和侵襲能力的變化，以初步探討LAMA4基因?qū)戆〩ep-2細胞株增殖和侵襲能力的影響及作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 Hep-2喉癌細胞株購于上海中科院細胞庫。DMEM培養(yǎng)基、FBS、0.25%胰蛋白酶軍購自Invitrogen公司；多克隆抗體購于Creative Biomart公司。βactin單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，二抗購于北京中杉公司。慢病毒由寧波大學(xué)生化實驗室包裝。細胞LAMA4基因的Genebank編號為NM 001105208。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Hep-2喉癌細胞株培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO237℃恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2.2 重組慢病毒感染Hep-2喉癌細胞株 用攜帶LAMA4全基因序列和LAMA4的小干擾RNA（sma11 interfering RNA，siRNA）序列的慢病毒感染Hep-2細胞株。將5×105個Hep-2細胞接種于24孔板，融合度達到50%～60%時分別用LAMA基因和siRNA的慢病毒和空載體病毒感染復(fù)數(shù)為50的病毒感染Hep-2細胞，72h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（green f1uorescent protein，GFP）表達陽性的細胞，計算重組慢病毒感染效率（重組慢病毒感染效率=GFP陽性細胞數(shù)/該視野下的總細胞數(shù)）。

1.2.3 基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix meta11oproteinases-2，MMP-2）、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶（membranetype-1 MMP，MT1-MMP）及LAMA4蛋白表達量檢測 （1）分別將基因沉默組、過表達組和空載體病毒對照組細胞收集起來，PBS洗滌2次，去上清液，迅速加入100μ1細胞裂解液，用細胞刮刀刮下細胞后超聲裂解，4℃離心20min。取上清液BCA法測定蛋白濃度后，按比例加入5×SDSPAGE上樣緩沖液，沸水浴10min后保存待用。配制5%濃縮膠及10%分離膠后，取20μg蛋白上樣進行SDSPAGE電泳。80V電壓于濃縮膠中電泳，待溴酚藍達到濃縮膠和分離膠分界時，改用120V電壓繼續(xù)電泳，至溴酚藍至凝膠底部時終止電泳。電泳后4℃下12V轉(zhuǎn)膜過夜，室溫封閉60min。將蛋白條帶按照分子量大小裁剪后，放入LAMA4和β-actin的相應(yīng)一抗（兔多克隆抗體）中，4℃過夜。次日，先將孵育一抗的PVDF膜取出，用緩沖液洗滌后，加入相應(yīng)的二抗（山羊抗兔）進行孵育，1h后將條帶取出，進行曝光處理，同時將膜上相應(yīng)的內(nèi)參條帶置入內(nèi)參抗體中進行孵育過夜，次日孵育二抗后曝光處理。以結(jié)果條帶與內(nèi)參β-肌動蛋白（βactin）吸光度值的比值作為目的條帶測量值。（2）依照前一步驟方法對3組細胞的蛋白分別進行提取,測定蛋白濃度后待用。將各組細胞取20μg蛋白上樣進行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。剪裁相應(yīng)分子量大小的PVDF膜孵育MMP-2、MT1-MMP的兔多克隆抗體，4℃過夜。次日孵育山羊抗兔二抗后，進行曝光處理。同樣與內(nèi)參比較后進行灰度分析得出測量值。

1.2.4 Hep-2細胞侵襲能力測定 將Transwe11小室（BD公司）上下室之間用孔徑為8 μm的硝酸酯膜分開，膜上鋪Matrige1膠，50μg/室。下室用10%FBS作為趨化因子，上室分別加入密度為1×106個/m1的Hep-2細胞400μ1。孵育24h，取出拭去膜上層剩余細胞，用4%多聚甲醛固定，蘇木素染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。每張膜隨機取5個視野，實驗重復(fù)3次，取均值作為最終結(jié)果。

1.2.5 細胞生長檢測 采用MTT法。選對數(shù)生長期的各組細胞，胰蛋白酶消化，以5 000個細胞/孔接種于96孔板中。連續(xù)培養(yǎng)3d，每天選擇3個孔，單孔加入20μ1（5mg/m1）MTT，37℃、5%CO2培養(yǎng)4h；每孔加入150μ1 DMSO，室溫下?lián)u床震蕩10min，使紫色結(jié)晶充分溶解，490nm測定吸光值。

1.2.6 MMP-2和MT1-MMP基因表達量檢測 分別提取各組細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，運用Rea1-time PCR方法檢測。Rea1-time PCR反應(yīng)總體系為20μ1，其中上下游引物各1 μ1，cDNA模板2μ1，SYBR Premix Ex TaqⅡ10μ1，雙蒸水補足體系至20μ1。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共40個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后采用比較閾值法測定目的基因的相對表達水平，可以直接得到目的基因相對于內(nèi)參基因（GAPDH）的定量。目的基因的表達水平=2-△Ct，其中△Ct=（目的基因Ct-參照基因Ct）。PCR引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，所得數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染效率 攜帶LAMA4基因片段和小干擾片段的重組慢病毒成功構(gòu)建，包裝慢病毒后，濃縮病毒懸液滴度達到5×105TU/μ1。重組慢病毒感染Hep-2細胞72h后，倒置熒光顯微鏡下觀察各孔中GFP的表達量，攜帶LAMA4全基因序列和siRNA序列的慢病毒及空載體病毒感染組中，Hep-2細胞GFP表達均成陽性，且陽性率達90%，詳見圖1。

圖1 光鏡下重組慢病毒感染Hep-2細胞株的情況（×200）

2.2 過表達和基因沉默后喉癌細胞中LAMA4蛋白水平的變化 對照組LAMA4蛋白相對表達量為0.56± 0.15，基因沉默組為0.39±0.16，過表達組為0.87±0.20，其電泳圖見圖2?；虺聊M相對表達量明顯低于對照組，過表達組相對表達量明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖2 LAMA4蛋白相對表達量的變化

2.3 LAMA4基因表達變化對Hep-2細胞侵襲能力的影響 Transwe11小室檢測發(fā)現(xiàn)，對照組Transwe11細胞數(shù)為（26±3.61）個，基因沉默組及過表達組分別為（45± 5.80）、（14±3.26）個，基因沉默組及過表達組與對照組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 LAMA4基因表達變化對喉癌細胞株生長的影響見表2。

表2 第1～3天喉癌細胞株生長情況的比較（吸光值）

由表2可見，第1～3天各組喉癌細胞生長情況并無明顯區(qū)別，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.5Hep-2細胞中MMP-2及MT1-MMP基因及蛋白表達變化的比較 見表3。

表3 Hep-2細胞中MMP-2及MT1-MMP基因表達變化的比較

由表3可見，與對照組比較，基因沉默組及過表達組MMP-2及MT1-MMP基因與蛋白表達均發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

在腫瘤組織中，基底膜和細胞外基質(zhì)是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的第一道屏障，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的生物學(xué)作用。研究表明，基底膜斷續(xù)或消失的實驗組，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率遠高于基底膜完整組。而腫瘤轉(zhuǎn)移則需先突破基底膜的限制，而后侵襲周圍組織，進而向遠處轉(zhuǎn)移。而完整的基底膜則具有限制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。Laminin-8是基底膜中主要的非膠原成分，參與細胞的生長、運動、分化等生物過程，介導(dǎo)腫瘤細胞和基底膜的黏附；其表達缺失程度提示著基底膜的破壞程度，預(yù)示腫瘤的穩(wěn)定性同時也受到了破壞[6]。而LAMA4是Laminin-8中重要的功能型亞基，其主要參與了腫瘤轉(zhuǎn)移過程中細胞間質(zhì)的降解、細胞微環(huán)境改變等步驟[3]。有研究表明，LAMA4可能具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[5,7]。

本研究成功構(gòu)建了攜帶LAMA4基因片段和小干擾片段的重組慢病毒，包裝慢病毒后濃縮病毒懸液滴度達到5×105TU/μ1。Transwe11侵襲小室實驗證明，在LAMA4基因過表達時，穿過小室的細胞數(shù)相比對照組減少，提示喉癌細胞株Hep-2的侵襲能力減弱。而將LAMA4基因沉默后，Hep-2細胞的侵襲能力顯著增強。由此可推斷，LAMA4在喉癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的過程中可能發(fā)揮著重要的作用。LAMA4的表達量與喉癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力呈負相關(guān)。細胞侵襲能力增強會直接導(dǎo)致喉癌的局部浸潤、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移，因此LAMA4在喉癌組織中的表達量可以作為預(yù)測喉癌侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因素之一。LAMA4影響喉癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制目前還不明確，而增加LAMA4基因的表達很可能對喉癌的侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制作用。因此，LAMA4基因可以作為喉癌藥物治療的潛在靶點。

在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的諸多研究中MMPs具有重要的意義。MMPs是一組鋅離子依賴性蛋白，其中MMP-2和MT1-MMP作為腫瘤細胞的侵襲標(biāo)志物,與基底膜的降解有著重要的關(guān)系[7-8]，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[9]。為了進一步探尋LAMA4的作用機制，采用Western B1ot檢測發(fā)現(xiàn)，LAMA4表達量變化時MMPs家族蛋白表達隨之發(fā)生變化；當(dāng)LAMA4基因被沉默后，MMP-2和MT1-MMP的表達升高，這進一步證實了當(dāng)LAMA4表達量減少時，喉癌細胞的侵襲相關(guān)分子的表達量升高，侵襲能力增強；而LAMA4過表達時，MMP-2和MT1-MMP的表達量隨之下降，喉癌細胞的侵襲能力進而降低。因此可以推斷，作為基底膜中的重要組成部分，LAMA4表達量的變化則與喉癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力有著密切的聯(lián)系，LAMA4可能是通過MMPs蛋白家族發(fā)揮作用。

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Laminin α4(LAMA4)regulates proliferation and invasion of laryngeal carcinoma Hep-2 cells

ObjectiveTo investigate the effects of laminin α4(LAMA4)on proliferation and invasion of laryngeal carcinoma Hep-2 cells．Methods Recombinant lentiviral vector with completed LAMA4 gene and LAMA4 siRNA sequences combined with GFP were constructed,respectively．Both of them were transfected into Hep-2 cells．The over-expression and knock-down rates were verified by western blot．MTT and Transwell assays were performed to determine the proliferation and invasion ability of transfected Hep-2 cells．The expressions of MMP-2,MT1-MMP proteins and mRNA were evaluated by Western blot and real-time PCR．Results Recombinant lentiviruses with LAMA4 gene and LAMA4 siRNA were successfully constructed．The virus titer was 5×105TU/μl．Lentivirus-mediated LAMA4 and LAMA4 siRNA were transfected into Hep-2 cells．Lower LAMA4 expression was detected in LAMA4 siRNA group,while over-expression was detected in LAMA4 group as compared to the control group(P＜0．05)．No effect on cell proliferation was detected in both LAMA or LAMA4 siRNA-transfected Hep-2 cells．Compared to control group the invasive ability of Hep-2 cells was increased in LAMA4 over-expression group and reduced in LAMA4 knock-down group(P＜0．05);meanwhile the expression of MMP-2,MT1-MMP proteins and mRNA levels were increased in LAMA4 over-expression group and decreased in LAMA4 knockdown group(P＜0．05)．Conclusion LAMA4 may be involved in the invasion of laryngeal carcinoma Hep-2 cells by regulating MMP-2 and MT1-MMP expression,suggesting that LAMA4 would be a potential therapeutic target for laryngocarcinoma．

Gene Laryngocarcinoma Lentivirus Invasion Proliferation

2013-11-06）

（本文編輯：歐陽卿）

寧波市科技創(chuàng)新團隊項目（2012B82019）

315040 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬李惠利醫(yī)院耳鼻喉科（鄔振華、沈志森）；寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所（李群、龔朝暉）