宮頸液基薄層脫落細(xì)胞聯(lián)合HPV及p16檢測在宮頸癌早期篩查中的臨床意義

陸曉青 陳潔瑛 舒青青 朱曉萍 劉素貞

宮頸液基薄層脫落細(xì)胞聯(lián)合HPV及p16檢測在宮頸癌早期篩查中的臨床意義

陸曉青 陳潔瑛 舒青青 朱曉萍 劉素貞

目的 探討薄層液基脫落細(xì)胞檢查（TCT）、高危型乳頭狀瘤病毒（HPV）DNA檢測及脫落細(xì)胞p16蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)檢測在宮頸癌早期篩查中的應(yīng)用價(jià)值。方法對TCT、HC2-HPV-DNA檢測至少一項(xiàng)異常的815例患者，利用剩余細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行p16免疫組化檢測，同時(shí)行陰道鏡及病理組織學(xué)檢查進(jìn)行對照。結(jié)果HC2-HPV-DNA的陽性率和宮頸脫落細(xì)胞中p16表達(dá)陽性率隨著宮頸病變嚴(yán)重程度的增加而明顯升高（P＜0．01）。HC2-HPV-DNA+TCT檢測提高了宮頸癌及癌前病變的檢出率，p16免疫細(xì)胞化學(xué)檢查則提高了檢測的特異度。結(jié)論在TCT和HC2-HPV-DNA檢測的基礎(chǔ)上，聯(lián)合應(yīng)用脫落細(xì)胞p16免疫細(xì)胞化學(xué)染色，可提高宮頸癌早期篩查的準(zhǔn)確性。

薄層液基脫落細(xì)胞檢查 人乳頭狀瘤病毒 p16 宮頸腫瘤 宮頸上皮內(nèi)瘤變

宮頸癌的發(fā)病有逐年上升的趨勢，我國宮頸癌發(fā)病及死亡人數(shù)占全世界的1/3。宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的長期過程，是多因素共同作用的結(jié)果。因此，早發(fā)現(xiàn)、早診斷對宮頸癌的防治具有重要意義。脫落細(xì)胞學(xué)檢查，特別是近年來推廣的液基薄層脫落細(xì)胞檢查（TCT），在宮頸癌的篩查中發(fā)揮了巨大作用。但是，即使每年接受細(xì)胞學(xué)檢查，仍然有約10%的婦女發(fā)展成浸潤性宮頸癌。高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染是宮頸癌發(fā)生的始動(dòng)因子，因此，高危型HPV DNA檢測，如二代雜交捕獲法（HC2-HPV-DNA），在宮頸癌篩查中也有重要作用。p16蛋白異常表達(dá)和HPV感染與宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）及宮頸癌均有密切的關(guān)系[1]，并且隨著病變的加重而呈動(dòng)態(tài)變化，它們在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價(jià)值開始受到重視。本研究將TCT、HC2-HPV-DNA和p16蛋白免疫組化染色檢測聯(lián)合應(yīng)用，并以組織學(xué)檢查結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對照，探討三者聯(lián)合應(yīng)用在宮頸癌早期篩查中的臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象 本院門診2012-01—2013-06共對7 161例患者進(jìn)行TCT、HC2-HPV-DNA聯(lián)合檢測，其中至少一項(xiàng)檢查異常者815例。815例患者年齡18～68歲，平均（35.4±6.5）歲；均為已婚或未婚有性生活史3年以上；全部行陰道鏡檢查及病理學(xué)活檢，剩余細(xì)胞學(xué)標(biāo)本重新制片，進(jìn)行p16免疫組化染色。

1.2 方法

1.2.1 TCT 采用寧波美生公司的TCT檢測儀，按操作說明進(jìn)行制片。由兩位有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生按TBS分類法（2001年）標(biāo)準(zhǔn)診斷，報(bào)告結(jié)果包括：正常范圍（NILM）、意義不明的非典型鱗狀細(xì)胞（ASC-US）、低度鱗狀上皮內(nèi)瘤變（LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)瘤變（HSIL）、鱗狀細(xì)胞癌（SCC）。ASC-US及以上定義為TCT檢查陽性，剩余標(biāo)本均保存于-20℃冰箱。

1.2.2 HC2-HPV-DNA檢測 采用美國Digene公司提供的第二代雜交捕獲技術(shù)，LV/CO值≥1.0判定為高危HPV DNA陽性。

1.2.3 宮頸脫落細(xì)胞中p16免疫組化檢測 剩余細(xì)胞學(xué)標(biāo)本制成薄片，95%乙醇固定30min、蒸餾水漂洗，抗原熱修復(fù)后，免疫組化SP法檢測p16蛋白。鼠抗人單克隆抗體p16和SP試劑盒等均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果判斷：p16表達(dá)定位于細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)，黃色或棕色染色為陽性，按陽性細(xì)胞所占比例及分布情況分級(jí)。陰性（-）：單個(gè)細(xì)胞染色，陽性細(xì)胞數(shù)＜5%；弱陽性（+）：散在或小的細(xì)胞團(tuán)染色，陽性細(xì)胞數(shù)5%～24%；陽性（++）：片狀或簇狀細(xì)胞染色，陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%；強(qiáng)陽性（+++）：彌散的細(xì)胞著色，陽性細(xì)胞數(shù)＞50%。

1.2.4 陰道鏡檢查與宮頸活檢 由陰道鏡專職醫(yī)師進(jìn)行操作，對可疑病灶進(jìn)行鏡下定位活檢，若鏡下未發(fā)現(xiàn)明顯病灶或圖像不滿意，則取宮頸多點(diǎn)組織活檢，所有組織病理學(xué)檢查均由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生作出診斷。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料的統(tǒng)計(jì)和分析采用χ2檢驗(yàn)，并計(jì)算高危型HPV檢測、p16免疫組化診斷宮頸病變的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值等。

2 結(jié)果

2.1 TCT與病理組織學(xué)檢查結(jié)果的符合情況 見表1。

由表1可見，TCT與病理組織學(xué)診斷的一致性較好（χ2=1104.86，P＜0.01）。

2.2 HC2-HPV-DNA檢測與病理組織學(xué)檢查結(jié)果的符合情況 見表2。

由表2可見，HPV-DNA陽性率隨著宮頸病變程度的增加而明顯增高（χ2=160.36，P＜0.01）。

表1 TCT與病理組織學(xué)檢查結(jié)果的符合情況[例（%）]

表2 HC2-HPV-DNA檢測與病理組織學(xué)檢查結(jié)果的符合情況[例（%）]

2.3 不同TCT診斷患者p16蛋白的表達(dá)情況 見表3。

表3 不同TCT診斷患者p16蛋白的表達(dá)情況

由表3可見，隨著TCT診斷級(jí)別的增高，p16蛋白陽性率呈明顯增加的趨勢。

2.4 不同病理組織學(xué)診斷患者p16蛋白表達(dá)情況 見表4。

表4 不同組織病理學(xué)診斷患者p16蛋白的表達(dá)情況

根據(jù)組織學(xué)診斷結(jié)果，將患者進(jìn)一步分成≤CINI和≥CINII兩組，宮頸脫落細(xì)胞p16蛋白表達(dá)陽性率分別為41.72%（262/628）和97.86%（183/187），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)（χ2=183.215，P＜0.01）。

2.5 3種方法診斷宮頸病變效能的比較 以病理組織學(xué)診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)，TCT、HC2-HPV-DNA及CT+HC2-HPV-DNA檢測對于病理組織學(xué)診斷≥CINI患者的診斷效能見表5。

表5 TCT、HC2-HPV-DNA單獨(dú)與聯(lián)合檢測效能的比較（%）

由表5可見，TCT與HC2-HPV-DNA聯(lián)合檢測能提高檢測的靈敏度和特異度。進(jìn)一步分析顯示，TCT、HC2-HPV-DNA和p16聯(lián)合檢測對CINI及以上病變的靈敏度為100%，特異度為91.46%（407/445），三者聯(lián)合應(yīng)用特異度較高（χ2=119.247，P＜0.01）。

3 討論

宮頸癌是最常見的女性惡性腫瘤，其病死率高居女性癌癥的第2位。宮頸癌的發(fā)生要經(jīng)過一個(gè)較長的癌前病變階段，在這個(gè)階段通過規(guī)范的防癌篩查，盡早發(fā)現(xiàn)、診斷并治療宮頸病變就可以阻斷其發(fā)展為宮頸癌[2-3]。目前臨床上常用的篩查方法有：TCT、HC2-HPV-DNA檢測等。細(xì)胞學(xué)檢查在宮頸癌早期篩查中發(fā)揮了巨大的作用，但據(jù)統(tǒng)計(jì)包括TCT在內(nèi)的細(xì)胞學(xué)檢查技術(shù)只能發(fā)現(xiàn)約51%的宮頸癌前病變及宮頸癌，細(xì)胞學(xué)與病理組織學(xué)的對比研究提示兩者診斷符合率大致在70%～80%[4]。進(jìn)一步提高宮頸癌早期篩查技術(shù)的敏感度和特異度已經(jīng)成為當(dāng)前宮頸癌防治技術(shù)亟待克服的難題?，F(xiàn)代分子生物學(xué)研究表明高危型HPV DNA檢測可能作為宮頸癌前病變的最敏感的篩查方法[5-7]。但是，由于只有高危型HPV的持續(xù)性感染才能導(dǎo)致宮頸癌及其前期病變的發(fā)生，而多數(shù)可能呈現(xiàn)的是高危型HPV的一過性感染，這些患者與宮頸癌的發(fā)生關(guān)系并不密切。因此，HPV DNA檢測作為單獨(dú)篩查方法存在特異性過低的缺點(diǎn)，尚不能應(yīng)用于初篩工作。

p16基因又稱多瘤抑制因子（MTS1）基因或CDKN2基因，是NK4家族的重要成員，編碼產(chǎn)物是p16蛋白。p16基因的缺失與突變在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。Gupa等[8]和Muluany等[9]發(fā)現(xiàn)在宮頸各種病變中，p16表達(dá)的陽性率隨病變程度增加而升高，表達(dá)強(qiáng)度也由弱到強(qiáng)，提示p16檢測可作為診斷宮頸癌前病變及宮頸癌的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，宮頸脫落細(xì)胞中p16表達(dá)的陽性率也隨著宮頸細(xì)胞學(xué)級(jí)別的升高而增加，與組織學(xué)宮頸病變程度密切相關(guān)，與國外Negri等[10]的研究結(jié)果一致。

本研究通過TCT、HC2-HPV-DNA和脫落細(xì)胞p16免疫組化檢測與病理組織學(xué)檢查對比發(fā)現(xiàn)，如果僅用TCT檢測宮頸病變時(shí)，有一部分患者可能存在過度診斷的問題；而如果僅使用HC2-HPV-DNA檢測、篩查宮頸病變，將漏診相當(dāng)一部分低度病變，兩者結(jié)合可提高診斷宮頸病變的敏感度，降低漏診率；但在提高宮頸病變檢出率的同時(shí)，卻降低了診斷的特異度，有可能導(dǎo)致過度診斷與治療。聯(lián)合p16免疫組化檢測，則大大提高了檢測結(jié)果的特異度，尤其對診斷CINII及以上病變的敏感度、特異度更高。在臨床工作中，CINI通常只需要隨訪，而CINII及以上病變則需要積極治療。因此，脫落細(xì)胞學(xué)p16檢測對于指導(dǎo)臨床治療顯得更有價(jià)值。綜上所述，在TCT或HC2-HPV-DNA檢測結(jié)果陽性的基礎(chǔ)上，結(jié)合p16蛋白免疫組化染色，將在一定程度上提高宮頸癌及癌前病變篩查的靈敏度和準(zhǔn)確性，有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值和推廣前景。

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Thin cytology test and HPV DNA detection combined with p16 immunocytochemistry in screening of early cervical cancer

Objective To evaluate the application of thin cytology test(TCT)and Hybrid Capture 2-high risk HPV-DNA test (HC2-HPV-DNA)combined with p16 immunocytochemical staining in screening of early cervical cancer．MethodsTotal 815 women underwent TCT and HC2-HPV-DNA testing,the specimens with at least one abnormal finding were subject to p16 immunocytochemical examination,and biopsy under colposcopy was also performed for these patients．ResultsThe positive rate of both HC2-HPV-DNA test and p16 expression increased with the degree of cervical lesions(P＜0．01)．Simultaneous detection of TCT and HC2-HPV-DNA increased the detection rate of cervical cancers and cancer precursor lesions．Incorporation of these two tests with p16 Immunocytochemical staining improved the specificity of detection．ConclusionTCT and HC2-HPV-DNA detection combined with immunocytochemical staining for p16 can improve the specificity of cervical cancer screening．

TCT Human papillary virus p16 Cervical tumorCervical intraepithelial neoplasm

2013-08-29）

（本文編輯：沈叔洪）

衢州市科技局科研立項(xiàng)課題（20121092）

324000 衢州市婦幼保健院病理科（陸曉青、劉素貞），婦科（陳潔瑛、舒青青）；衢州市職業(yè)技術(shù)學(xué)院（朱曉萍）

陸曉青，E-mail：1647993226@qq.com