脂氧素A4受體ALXR在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位及異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及意義

王建芳 范偉榮 劉杰 伊碧霞 章根琴

脂氧素A4受體ALXR在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位及異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及意義

王建芳 范偉榮 劉杰 伊碧霞 章根琴

目的 探討脂氧素A4受體ALXR在子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）患者在位及異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平及其臨床意義。方法因EMs行腹腔鏡手術(shù)治療的患者27例，留取在位子宮內(nèi)膜組織（EMs在位內(nèi)膜組）和異位子宮內(nèi)膜組織（EMs異位內(nèi)膜組），取同期因良性卵巢囊腫行腹腔鏡手術(shù)治療患者30例為對(duì)照組，留取宮腔內(nèi)正常內(nèi)膜組織。分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、免疫組化法檢測(cè)各組內(nèi)膜組織中ALXR mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果EMs異位內(nèi)膜組ALXR mRNA表達(dá)水平為0.069±0.020，EMs在位內(nèi)膜組為0.039±0.013，對(duì)照組為0.019±0.008,EMs異位和在位內(nèi)膜組的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05），EMs異位內(nèi)膜組又高于在位內(nèi)膜組（P＜0.05）。EMs異位和在位內(nèi)膜組ALXR蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論ALXR mRNA及蛋白在EMs異位及在位內(nèi)膜組織中均呈高表達(dá)狀態(tài)，推測(cè)ALXR可能與EMs發(fā)病有關(guān)。

子宮內(nèi)膜異位癥 脂氧素A4 脂氧素A4受體ALXR 炎癥

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）即具有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔被覆黏膜以外的身體其它部位，是育齡婦女的常見病、難治病，其主要以不孕、慢性疼痛及粘連形成為特征，嚴(yán)重影響著患者的健康和生活質(zhì)量。目前其發(fā)病機(jī)制仍尚不清楚，但作為一種炎癥性相關(guān)疾病的觀點(diǎn)已得到廣泛支持。脂氧素A4（lipoxins A4，LXA4）作為炎癥反應(yīng)的內(nèi)在“剎車信號(hào)”，通過與其受體ALXR結(jié)合而發(fā)揮廣泛強(qiáng)效的促炎癥消退效應(yīng)。最近研究發(fā)現(xiàn)LXA4與EMs有關(guān)[1]。本研究檢測(cè)了EMs患者在位、異位子宮內(nèi)膜以及正常子宮內(nèi)膜中ALXR mRNA及蛋白表達(dá)水平，探討ALXR在EMs的表達(dá)水平及其意義，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2012-02—09本科行腹腔鏡手術(shù)治療的患者為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者年齡20～40歲；

（2）具有相對(duì)規(guī)則的月經(jīng)周期；（3）術(shù)前3個(gè)月未使用過內(nèi)分泌藥物，6個(gè)月內(nèi)無妊娠及哺乳史、刮宮手術(shù)史；（4）既往無EMs病史；（5）術(shù)前無圍絕經(jīng)期癥狀者；（6）組織學(xué)診斷排除惡性腫瘤。根據(jù)內(nèi)膜組織的來源分為3組：（1）EMs異位內(nèi)膜組（27例）：手術(shù)病理證實(shí)為EMs，術(shù)中取典型異位內(nèi)膜組織（腹腔、盆壁及卵巢異位灶）。（2）EMs在位內(nèi)膜組（27例）：以上患者同時(shí)負(fù)壓刮取宮腔內(nèi)膜組織。（3）對(duì)照組（30例）：因良性卵巢囊腫行手術(shù)治療的患者，不合并EMs或子宮腺肌癥，負(fù)壓刮宮方法留取宮腔內(nèi)膜組織，術(shù)后病理證實(shí)為正常子宮內(nèi)膜?；颊吣挲g20～40（29.4±0.2）歲；對(duì)照組年齡20～40（30.3± 0.4）歲≥兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)內(nèi)膜組織中ALXR mRNA的表達(dá)水平 用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照Genbank中人ALXR、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehydephosphate dehdrogenase，GAPDH）(內(nèi)參照)基因序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由杭州赫貝科技有限公司合成。ALXR引物正義鏈：5＇-GCCATCTGCTATGGGCTCAT-3＇，反義鏈5＇-CGTAAGGGACGGCTGGATTT-3＇，擴(kuò)增片段為91 bp。內(nèi)參照為GAPDH，正義鏈為5＇-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3＇， 反 義 鏈 為 5＇-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3＇，擴(kuò)增片段為258 bp。采用全自動(dòng)熒光定量PCR儀（CFX connect Real-Time PCR System）進(jìn)行反應(yīng)。20μl反應(yīng)體系中實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)預(yù)混液（2×）10.0μl，上下游引物各0.4μl，cDNA 2.0μl（終濃度為0.2μmol/L）。95.0°C預(yù)變性3min，95.0°C變性10s，61.0°C退火/延伸20s，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線條件為：從70～95°C，每10s上升0.5°C。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析和測(cè)序以確定產(chǎn)物的特異性，產(chǎn)物測(cè)序由杭州赫貝科技有限公司完成。PCR分析軟件BIO-RAD CFX Manager進(jìn)行自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果。循環(huán)閾值（threshold cycle，Ct）與mRNA PCR初始表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)?！鰿t值代表目的基因相對(duì)于內(nèi)參照基因的表達(dá)量。先將不同組別的△Ct值樣本均數(shù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），再用2-ΔΔCt公式進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.2 免疫組化SP法檢測(cè)內(nèi)膜組織中ALXR蛋白定位表達(dá) 標(biāo)本用10%甲醛溶液固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋。蠟塊切片（4μm）后，脫蠟至水。滴加體積分?jǐn)?shù)3% H2O2溶液，室溫下孵育10min。用微波進(jìn)行抗原熱修復(fù)。滴加1∶100稀釋的一抗（美國(guó)novus公司）,37°C孵育2h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2min×3次。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片后在顯微鏡下觀察，背景為紫藍(lán)色，陽性表達(dá)在胞質(zhì)，呈棕褐色。高倍視野下隨機(jī)拍5個(gè)視野（×200），并用病理圖像分析軟件（IPP）進(jìn)行蛋白半定量分析，計(jì)算平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,測(cè)得計(jì)量資料均以表示，進(jìn)行方差齊性及正態(tài)性檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ALXR mRNA在在位子宮內(nèi)膜、異位子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜的表達(dá)。

2.1.1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)ALXR mRNA通過熔解曲線驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物 結(jié)果顯示為單峰,表明產(chǎn)物具有特異性，見圖1-2。

圖1GAPDH熔解曲線

圖2 ALXR熔解曲線

2.1.2 各內(nèi)膜組織中ALXRmRNA的表達(dá)水平比較 ALXRmRNA在異位子宮內(nèi)膜的表達(dá)水平為0.069±0.020，在位子宮內(nèi)膜組中的表達(dá)水平為0.039±0.013，明顯高于對(duì)照組的0.019±0.008，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.328、6.943，均P＜0.05），并且異位子宮內(nèi)膜中ALXR mRNA的表達(dá)水平高于在位子宮內(nèi)膜中的表達(dá)水平，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-6.303，P＜0.05）。

2.2 各組內(nèi)膜組織中ALXR蛋白定位及半定量表達(dá)水平比較 AXLR蛋白在子宮內(nèi)膜的間質(zhì)細(xì)胞及腺細(xì)胞中均有表達(dá)，其定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。AXLR蛋白在各組間的表達(dá)及定位見圖3。AXLR在異位子宮內(nèi)膜和在位子宮內(nèi)膜中相對(duì)表達(dá)量為分別為0.045±0.011、0.023±0.013，均高于對(duì)照組的0.008±0.003，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.079、6.528，均P＜0.05）。

圖3 ALXR蛋白在不同子宮內(nèi)膜的表達(dá)（A：EMs異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞中有大量ALXR蛋白表達(dá)，SP法，×400；B：EMs在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞中有中量ALXR蛋白表達(dá)，SP法，×400；C：對(duì)照組內(nèi)膜細(xì)胞中無明顯AXLR蛋白表達(dá)，SP法，×400）

3 討論

目前，ALXR在EMs中的研究非常有限，Motohashi等[1]曾報(bào)道過ALXR在EMs患者異位內(nèi)膜組織中的mRNA水平高于正常人子宮內(nèi)膜組織。本研究結(jié)果與Motohashi等的研究結(jié)論一致。本研究發(fā)現(xiàn)EMs患者異位子宮內(nèi)膜組織中ALXR mRNA和蛋白水平顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織，并且EMs患者異位子宮內(nèi)膜組織中ALXR mRNA和蛋白水平高于EMs患者在位子宮內(nèi)膜。

LXA4作為一類新型的內(nèi)源性脂質(zhì)抗炎消退介質(zhì)，通過與其受體ALXR發(fā)揮抗炎、促炎癥消退的雙重作用，被認(rèn)為是內(nèi)源性的炎癥“剎車信號(hào)”，可以協(xié)調(diào)急性炎癥到慢性炎癥的轉(zhuǎn)化，以達(dá)到控制炎癥，削弱慢性炎癥的趨勢(shì)。1992年，F(xiàn)iore等在人中性白細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)一種與LXA4高親和性的特異G-白偶聯(lián)受體；隨后這種G-蛋白偶聯(lián)受體被鑒定為ALXR（FPRL-1）。人類的ALXR屬于G-蛋白偶聯(lián)受體家族，包括FPRI、FPRL-1/ ALXR和FPR3三個(gè)成員，在中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞、活化的T細(xì)胞等免疫細(xì)胞以及在腸上皮細(xì)胞、滑膜成纖維細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞等固有細(xì)胞中均有表達(dá)[2]。研究發(fā)現(xiàn)LXA4可通過其受體ALXR作用于多種類型的細(xì)胞，在抗炎促炎癥消退、減輕組織侵襲、抑制血管生成以及抗增殖、抗纖維化效應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[3-5]。另研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子可以上調(diào)ALXR的轉(zhuǎn)錄活性，提示ALXR的表達(dá)受炎性環(huán)境的調(diào)節(jié)[6]。

目前EMs發(fā)病機(jī)制尚不明確，但EMs作為一種炎癥性相關(guān)疾病的觀點(diǎn)已得到廣泛支持。一般認(rèn)為EMs是起始于子宮內(nèi)膜組織在腹腔內(nèi)膜的種植，而炎性環(huán)境對(duì)于這種疾病的發(fā)展可能起著重要作用。EMs常伴隨著多種炎癥反應(yīng)，患者腹腔內(nèi)免疫炎癥環(huán)境的改變，促進(jìn)了異位灶的生存和增長(zhǎng)。越來越多的證據(jù)表明EMs中子內(nèi)膜組織的種植具有類似于炎癥的特征。與健康的婦女相比，EMs患者腹腔內(nèi)的數(shù)目和活性增加，而其分泌的一些與炎癥有關(guān)的因子如IL-1β，IL-6，IL-8，TNF-a，MCP-1，MMP-9等也有明顯的上升[7-9]。這些細(xì)胞因子通過自分泌或旁分泌發(fā)揮細(xì)胞間的通訊作用，并對(duì)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、白細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，和炎性細(xì)胞之間產(chǎn)生正反饋效應(yīng)[10]，進(jìn)一步增加組織侵襲、血管形成能力乃至局部性激素濃度，促進(jìn)子宮內(nèi)膜的異位存活，加重炎癥，引發(fā)疼痛和不孕[11]。

LXA4在EMs中的研究，目前尚處在一個(gè)起步階段，國(guó)內(nèi)外相關(guān)的研究還非常有限，但是這無法掩蓋LXA4在EMs中的研究和應(yīng)用前景。Motohashi等[1]首先研究了LXA4受體ALXR在雌性大鼠子宮內(nèi)膜、子宮肌膜和卵巢中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示ALXR在子宮內(nèi)膜和子宮肌膜中的基因表達(dá)顯著高于在卵巢中的表達(dá)，在動(dòng)情前期（proestrus）ALXR的基因表達(dá)顯著增加，而在動(dòng)情期（estrus）階段開始減少。該研究還發(fā)現(xiàn)孕酮可使ALXR表達(dá)明顯減少，雌激素使其微量減少，而促性腺激素對(duì)其表達(dá)幾乎沒有影響。而在子宮內(nèi)膜異位癥的大鼠模型中，ALXR的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組。Chen等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)外源性脂氧素（15-epi-LXA4）可顯著抑制子宮內(nèi)膜異位癥小鼠異位病灶的重量和大小，且不影響小鼠的性周期，也無明顯不良反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)15-epi-LXA4顯著降低內(nèi)異癥小鼠腹腔免疫細(xì)胞中IL-1β、TNF-a的基因和蛋白表達(dá)；同時(shí)，15-epi-LXA4還可顯著降低MMP-2和MMP-9的表達(dá)和酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)EMs患者異位子宮內(nèi)膜組織中ALXR mRNA和蛋白水平顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織，并且EMs患者異位子宮內(nèi)膜組織中ALXR mRNA和蛋白水平亦高于EMs患者在位子宮內(nèi)膜，推測(cè)EMs患者體內(nèi)子宮內(nèi)膜細(xì)胞異常增殖和組織侵襲可能誘導(dǎo)ALXR的表達(dá)，而LXA4與ALXR介導(dǎo)的促炎癥消退效應(yīng)能否抑制EMs的發(fā)生、發(fā)展尚有待進(jìn)一步的研究。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于LXA4與EMs的研究尚處于起步階段，進(jìn)一步的研究將有助于揭示EMs的炎癥性發(fā)病機(jī)制，并可為EMs的抗炎藥物的研制提供理論基礎(chǔ)。

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Expression of lipoxin A4 receptor ALXR in eutopic and ectopic endometrium of patients with endometriosis

Objective To investigate the expression of lipoxin A4 receptor(ALXR)in eutopic and ectopic endometrium of patients with endometriosis.MethodsTwenty seven patients with endometriosis underwent laparoscopic surgery in our hospital between February 2012 and September 2012,the tissue samples of eutopic and ectopic endometrium were collected; and uterine endometrium samples were also collected from 30 patients with benign ovary cysts as controls.The mRNA and protein expression of ALXR in the eutopic endometrium,ectopic endometrium of endometriosis patients and control endometrium were detected by real-time fluorescent quantitative RT-PCR and immunohistochemistry,respectively.ResultsThe mRNA expression of ALXR was 0.069±0.013 in ectopic endometrium and 0.039±0.013 in eutopic endometrium of endometriosis, which were significantly higher than that of the control(0.019±0.008,P＜0.05).The mRNA expression of ALXR in the ectopic endometrium was also higher than that of eutopic endometrium of endometriosis(P＜0.05).Compared with the control,the expression of ALXR protein in eutopic and ectopic endometrium of endometriosis were increased(P＜0.05).ConclusionThe ectopic and eutopic endometrium in patients with endometriosis shows high expression of lipoxin A4 receptor mRNA and protein, which indicates that ALXR may be associated with the pathogenesis of endometriosis.

Endometriosis Lipoxin A4 Lipoxin A4 receptor ALXR Inflammation

2014-04-08）

（本文編輯：沈昱平）

金華市科技局資助項(xiàng)目（2011-3-042）

321000 金華市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科

王建芳，E-mail：jefayeking@163.com