microRNA-195在食管鱗狀上皮細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

王江峰 凌志強 毛偉敏

microRNA-195在食管鱗狀上皮細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

王江峰 凌志強 毛偉敏

目的 檢測microRNA-195（miR-195）在食管鱗狀上皮細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平，探討其臨床病理生理學(xué)意義。方法應(yīng)用實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)法檢測94例食管鱗狀上皮細(xì)胞癌組織和配對癌旁正常組織中miR-195的表達(dá)水平，并分析miR-195表達(dá)水平與食管鱗狀上皮細(xì)胞癌患者臨床病理學(xué)特征及預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果食管鱗狀上皮細(xì)胞癌組織中miR-195不同程度低表達(dá)45例（47.9%），正常表達(dá)39例（41.5%），高表達(dá)10例（10.6%）。miR-195低表達(dá)者比例在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同TNM分期者中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；miR-195表達(dá)水平與患者無瘤生存期顯著相關(guān)，是食管鱗狀上皮細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨立危險因素。結(jié)論miR-195下調(diào)影響食管鱗狀上皮細(xì)胞癌進(jìn)展和患者預(yù)后，可能起著抑癌基因功能。

microRNA-195 食管鱗狀上皮細(xì)胞癌 無瘤生存期 抑癌基因

近年來世界范圍內(nèi)食管癌的發(fā)病率和病死率已居惡性腫瘤第6位[1]。食管癌的病理類型主要為鱗狀細(xì)胞癌和腺癌，鱗狀細(xì)胞癌主要位于食管中上段，占食管癌的90%；其余少部分為腺癌，一般位于食管下段[2]。食管鱗狀上皮細(xì)胞癌（簡稱食管鱗癌）確診時往往已為晚期，盡管治療方案的選擇迅速發(fā)展，但侵襲和轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后不佳。微小RNA（microRNAs）是一類長19～22nt的單鏈非編碼小分子RNA，通過與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)不完全互補結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上影響靶基因mRNAs降解或翻譯[3-4]。一個miRNA可通過調(diào)控多個靶基因mRNAs發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的功能[5-6]。有研究表明，microRNA-195（miR-195）在肝癌和結(jié)腸、直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯降低，且與腫瘤的增殖、周期、淋巴轉(zhuǎn)移和預(yù)后等相關(guān)[7-8]。也有研究表明，miR-195在食管鱗癌中的表達(dá)與細(xì)胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)[9]。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法（realtime PCR）檢測食管鱗癌組織中miR-195的表達(dá)水平，分析其與患者臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系，旨在探討miR-195的表達(dá)在食管癌進(jìn)展、預(yù)后中的意義,為預(yù)測食管癌轉(zhuǎn)移潛能和評估預(yù)后尋找新的生物學(xué)指標(biāo)，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2008-02—2009-11浙江省腫瘤醫(yī)院食管癌手術(shù)切除組織標(biāo)本94例，均為食管鱗癌及其配對癌旁正常組織，患者男82例，女12例，年齡46～80歲，平均（63.26±7.88）歲。術(shù)前未經(jīng)任何放化療及其它治療，排除自身免疫性疾病或嚴(yán)重感染性疾??；癌旁正常組織取自腫瘤邊緣5cm外區(qū)域肉眼下正常食管組織，食管癌根治術(shù)中標(biāo)本切取后均立即放入液氮，并立即轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。食管癌TNM分期、腫瘤分級均參照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）的標(biāo)準(zhǔn)。記錄患者是否吸煙（指一生中連續(xù)或累計吸煙6個月以上，并且平均每天至少吸1支）和飲酒（指平均每周1次以上飲用任何酒）[10]。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，患者均進(jìn)行電話隨訪，隨訪截止時間為2012-07-04。

1.2 試劑 RNA提取試劑盒MirNeasy Mini Kit購自德國Qiagen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRmiRNA cDNA Synthesis Kit（D350A）和real-time PCR試劑盒SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（DRR081A）購于日本TaKaRa公司。引物由上海捷瑞公司合成。Real time RT-PCR上游引物序列：miR-195：5′-TAGCAGCACAGAAATATTGGC-3′，內(nèi)參基因U6：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游通用引物由反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRmiRNA cDNA Synthesis Kit（D350A）提供。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取 按照MirNeasy Mini Kit試劑盒說明書提取腫瘤組織及對應(yīng)正常組織的總RNA，紫外分光光度計測量，檢測提取總RNA的濃度和純度，測定吸光度值（A），要求A260/A280=1.8～2.1。凝膠電泳測定RNA的完整性。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄 采用梯度PCR儀（Bio-Rad S1000），按PrimeScrip miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書將上述提取總RNA（1μg）進(jìn)行cDNA的合成。逆轉(zhuǎn)錄體系（20μl）：2×miRNA Reaction Buffer Mix 10μl，0.1%BSA 2μl，miRNA PrimeScriptRRT Enzyme Mix 2μl，Total RNA 1μl，RNase Free dH2O 5μl。反應(yīng)過程：37℃60min，85℃5s，4℃30min。

1.3.3 PCR擴增 RT-PCR的PCR擴增及溶解曲線分析均使用 ABI 7500PCR儀（Applied Biosystems）。PCR試劑采用日本Takara公司Premix Ex TaqTMⅡ，具體操作參照SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ說明書。結(jié)果按 2-ΔΔCT法分析：ΔCT=Ct（miR-195）-Ct（U6）；按ΔΔCT=ΔCT（癌組織）-ΔCT（癌旁正常組織）計算miR-195在癌組織和癌旁正常組織中表達(dá)情況，當(dāng)ΔΔCT＞1，表示表達(dá)下降；-1＜ΔΔCT＜1，表示表達(dá)正常；ΔΔCT＜-1，表示表達(dá)升高，最終采用2-ΔΔCT計算相對改變倍數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，采用配對樣本t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，影響患者預(yù)后的多因素分析采用Cox回歸。

2 結(jié)果

2.1 miR-195在食管鱗癌和癌旁正常組織中的表達(dá)水平 94例食管鱗癌標(biāo)本中miR-195相對癌旁正常組織為低表達(dá)45例（47.9%），正常表達(dá)39例（41.5%），高表達(dá)10例（10.6%）。采用2-ΔΔCT計算miR-195相對癌旁正常組織的表達(dá)倍數(shù)，各樣本相對表達(dá)倍數(shù)取對數(shù)（lg2-ΔΔCT）統(tǒng)計作圖，詳見圖1。

圖1 患者食管癌組織中相對正常組織的表達(dá)量

2.2 miR-195低表達(dá)者比例與臨床病理特征的關(guān)系miR-195低表達(dá)者比例在淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移和不同腫瘤TNM分期者中的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者miR-195低表達(dá)者比例高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；Ⅰ/Ⅱ期患者miR-195低表達(dá)者比例低于Ⅲ/Ⅳ期患者。而不同年齡、性別、分化程度、腫瘤位置、浸潤程度及有無腫瘤家族史、吸煙史、飲酒史者間miR-195低表達(dá)者比例的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），詳見表1。

2.3 miR-195表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

2.3.1 miR-195表達(dá)水平與生存時間的關(guān)系 94例食管鱗癌患者按miR-195相對表達(dá)水平分為低表達(dá)組（45例）和非低表達(dá)組（49例），采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并比較兩組的無瘤生存期和危險函數(shù)，結(jié)果顯示非低表達(dá)組患者較低表達(dá)組患者有生存優(yōu)勢，且低表達(dá)組患食管鱗癌的危險度較非低表達(dá)組高（P＜0.05），詳見圖2。

2.3.2 臨床病理特征、生活習(xí)慣與生存時間的關(guān)系Cox回歸分析結(jié)果顯示，miR-195的表達(dá)水平作為食管鱗癌患者預(yù)后的影響因素，風(fēng)險系數(shù)為9.503（P＜0.05），表明miR-195的表達(dá)水平是影響患者生存的獨立危險因素，詳見表2。

表1 食管鱗癌組織miR-195低表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表2 影響94例食管鱗癌患者無瘤生存的多因數(shù)分析

3 討論

食管鱗癌的發(fā)生和發(fā)展是一個多因素、多步驟的過程，也是多基因發(fā)生異常表達(dá)的過程。隨著研究的進(jìn)展，許多小分子生物學(xué)標(biāo)志物表達(dá)的變化與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，且在臨床上廣泛的應(yīng)用[11]。microRNAs是一類大小約20nt，具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼小分子RNA[12]。Matsushima等[13]研究發(fā)現(xiàn)：miR-21、miR-129、miR-373、miR-103和miR-107在食管癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)較正常高，它們參與了食管鱗癌的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡及進(jìn)展，同時降低了食管鱗癌患者的生存率，表現(xiàn)為癌基因的功能；而miR-153、miR-100、miR-125b、miR-10a、miR-99a、miR-376a、miR-379、miR-651和miR-146b則表達(dá)下降，表現(xiàn)為抑癌基因的功能。因此，microRNAs與腫瘤調(diào)控的關(guān)系成為了研究的熱點。

圖2 94例食管癌患者中miR-195表達(dá)水平與患者生存和疾病危險度的關(guān)系

microRNA-195是一個位于17p13.1染色體的小分子RNA，屬于miR-15/miR-16家族，其在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)。Wang等[7]和Xu等[8]研究均發(fā)現(xiàn)，miR-195在肝癌組織中的表達(dá)較正常組織的表達(dá)顯著下調(diào)。Wang等證實miR-195通過抑制VEGF、VAV2和CDC42基因的表達(dá)從而抑制肝癌細(xì)胞的血管生成和轉(zhuǎn)移。Xu等也發(fā)現(xiàn)miR-195使肝癌細(xì)胞阻止于G1/S期，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和進(jìn)展。Soon等[14]應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究22例腎上腺皮質(zhì)癌中micorRNAs表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，miR-195在腎上腺皮質(zhì)癌中的表達(dá)較腎上腺皮質(zhì)瘤顯著下調(diào)。同時，miR-195的低表達(dá)降低了腎上腺皮質(zhì)癌患者的生存期。Wang等[7]研究同樣發(fā)現(xiàn)，miR-195在85例結(jié)腸直腸癌中的表達(dá)明顯下調(diào)，且miR-195的低表達(dá)和結(jié)腸直腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期成負(fù)相關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)miR-195最初是通過調(diào)控細(xì)胞周期發(fā)揮癌基因的功能，miR-195在體外能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的克隆形成和腫瘤的進(jìn)展。Liu等[15]也同樣報道，miR-195通過直接調(diào)控靶基因cyclin D1和CDK6使肺癌細(xì)胞株的細(xì)胞周期阻滯于G1期，其細(xì)胞機制可能是通過Rb-E2F信號通路發(fā)揮癌基因的功能，調(diào)控多個靶基因（CCND6、CDK6、E2F3等）阻滯細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)變。因此，miR-195可能是一個細(xì)胞周期相關(guān)的microRNA，其表達(dá)下調(diào)使一系列調(diào)控周期的靶基因發(fā)揮功能，阻滯細(xì)胞周期，減少腫瘤的進(jìn)展，發(fā)揮抑癌基因的功能。本研究結(jié)果與上述基本一致，在94例食管鱗癌組織標(biāo)本中，miR-195相對癌旁正常組織低表達(dá)為45例，正常表達(dá)39例，高表達(dá)10例。miR-195相對癌旁正常組織低表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較非低表達(dá)患者早；TNM分期Ⅲ/Ⅳ期的食管鱗癌組織中miR-195表達(dá)水平顯著低于Ⅰ/Ⅱ期食管鱗癌組織；miR-195相對癌旁正常組織低表達(dá)的患者預(yù)后較差。本研究表明miR-195相對低表達(dá)能加速腫瘤的進(jìn)展，減少患者的生存時間。多因素分析也表明miR-195的表達(dá)水平是影響食管鱗癌患者生存的獨立因素。

本研究結(jié)果提示miR-195可能是一種預(yù)測食管鱗癌進(jìn)展和預(yù)后指標(biāo)的小分子RNA，其低表達(dá)可能促進(jìn)食管鱗癌的浸潤和進(jìn)展，同時使患者的預(yù)后惡化。本研究只是初步證實了miR-195的表達(dá)與食管鱗癌的臨床病理特征及預(yù)后之間的相關(guān)性，miR-195在食管鱗癌中可能發(fā)揮著抑癌基因的功能，其具體的分子生物學(xué)機制仍需要進(jìn)一步的研究證實。

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（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

《浙江醫(yī)學(xué)》對醫(yī)學(xué)論文中有關(guān)實驗動物描述的要求

在醫(yī)學(xué)論文的描述中，凡涉及實驗動物者，在描述中應(yīng)符合以下要求：（1）品種、品系描述清楚，（2）強調(diào)來源，（3）遺傳背景，（4）微生物學(xué)質(zhì)量，（5）明確等級，（6）明確飼養(yǎng)環(huán)境和實驗環(huán)境，（7）明確性別，（8）有無質(zhì)量合格證，（9）有對飼養(yǎng)的描述（如飼料型、營養(yǎng)水平、照明方式、溫度、溫度要求），（10）所有動物數(shù)量準(zhǔn)確，（11）詳細(xì)描述動物的健康狀況，（12）對動物實驗的處理方式有單獨清楚的交代，（13）全部有對照，部分可采用雙因素方差分析。

本刊編輯部

Expression of microRNA-195 in esophageal squamous cell carcinoma and its clinical significance

Objective To investigate the expression of miR-195 in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)and its clinicopathological significance.MethodsThe expression of miR-195 in 94 ESCC samples and matched normal tissue samples was detected by real-time PCR.Results47.9%(45/94)of carcinoma samples showed low expression of miR-195,41.5% (39/94)was negatively expressed and 10.6%(10/94)showed high expression．The low expression of miR-195 was significantly correlated with lymph node metastasis,TNM staging and disease free survival.miR-195 expression level was an independent prognostic factor in patient with ESCC.ConclusionThe down-regulation of miR-195 is associated with the progression of ESCC and prognosis of the patients．

microRNA-195 ESCC DFS Tumor-suppressor

2013-11-07）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床學(xué)院腫瘤外科（王江峰、毛偉敏）；浙江省腫瘤醫(yī)院、浙江省腫瘤研究所（凌志強）

毛偉敏，E-mail:maowm1218@163.com