p27kip1蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及意義

程翅 張海峰 閆康鵬 梁磊

p27kip1蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及意義

程翅 張海峰 閆康鵬 梁磊

目的 探討p27kip1蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及意義。方法應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)結(jié)腸癌組織（觀察組40例）及癌旁正常組織（對(duì)照組20例）中p27kip1蛋白的表達(dá)，比較其陽性表達(dá)率，并比較分析觀察組不同分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者p27kip1蛋白的陽性表達(dá)程度。結(jié)果觀察組中p27kip1蛋白陽性表達(dá)16例（40．00%），對(duì)照組中p27kip1蛋白陽性表達(dá)15例（75．00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。高、中分化患者p27kip1蛋白的陽性表達(dá)程度明顯高于低分化患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者p27kip1蛋白的陽性表達(dá)程度明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者p27kip1蛋白陽性表達(dá)12例（63．16%），Ⅲ～Ⅳ期患者p27kip1蛋白陽性表達(dá)4例（19．05%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)論p27kip1蛋白作為抑癌因子具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡的能力，而組織中p27kip1蛋白的低表達(dá)可能導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。p27kip1蛋白可能作為臨床上檢測(cè)結(jié)腸癌的新指標(biāo)，有助于結(jié)腸癌的腫瘤分化、腫瘤轉(zhuǎn)移及腫瘤TNM分期的診斷。

p27kip1 結(jié)腸癌 結(jié)腸腫瘤

目前，結(jié)腸癌發(fā)病原因尚不清楚，可能與飲食、遺傳因素、致癌物質(zhì)、慢性炎癥、癌前病變等因素有關(guān)。1994年，Polyak等[1]發(fā)現(xiàn)的p27kip1基因位于人12號(hào)染色體的12p12～12p13.1交界處，包含2個(gè)有編碼功能的外顯子、1個(gè)無功能的外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，其產(chǎn)物為相對(duì)分子質(zhì)量為27 000的熱穩(wěn)定蛋白，含有198個(gè)氨基酸，能與細(xì)胞周期依賴激酶和周期素（cyclin）如cyclinF-cdk2、cyclinD-cdk4及cyclinD-cdk6等結(jié)合，并發(fā)揮其激酶抑制作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，多種人類腫瘤中存在p27kip1蛋白表達(dá)減少或缺失，而p27kip1蛋白水平與惡性腫瘤的生物學(xué)行為存在一定的負(fù)相關(guān)。目前，臨床上普遍認(rèn)為p27kip1基因是一種新的抑癌基因。Harvat等[2]發(fā)現(xiàn)，外源性加入純化的p27kip1蛋白或使內(nèi)源性p27kip1蛋白釋放增加均可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。因此，了解p27kip1蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)腫瘤的基因治療及相關(guān)腫瘤藥物治療靶點(diǎn)的選擇有著重要的臨床意義。p27kip1蛋白在胃癌[3]、肝癌[4]等腫瘤中呈低表達(dá)現(xiàn)象，其在結(jié)腸癌中是否也呈低表達(dá)現(xiàn)象呢？本研究旨在探討結(jié)腸癌中p27kip1蛋白的表達(dá)情況及意義，以期為結(jié)腸癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2012-01—2013-07月本院收治的40例結(jié)腸癌患者，組織標(biāo)本均為手術(shù)切除標(biāo)本，病理診斷結(jié)腸癌。術(shù)前均未行化療、放療及其他腫瘤相關(guān)治療。將40例患者的結(jié)腸癌組織標(biāo)本作為觀察組，其中男26例，女14例；年齡40～79（66±2）歲；TNM分期（1997年UICC分類分期法）：Ⅰ期11例，Ⅱ期8例，Ⅲ期11例，Ⅳ期10例；高分化癌11例，中分化癌12例，低分化癌17例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性21例，陰性19例。并隨機(jī)選取20例觀察組組織標(biāo)本的癌旁切緣2cm以上正常結(jié)腸組織標(biāo)本作為對(duì)照組，其中男12例，女8例，年齡40～79（64±2）歲。病理檢查確定為正常結(jié)腸組織。所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水后石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，分別用于免疫組化染色。

1.2 主要試劑 鼠抗人p27kip1單克隆抗體（北京中衫金橋生物有限公司國(guó)際代理；SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC），二步法免疫組化檢測(cè)試劑PV-9000（北京中衫金橋生物有限公司）；DAB顯色試劑盒（北京中衫金橋生物有限公司）。

1.3 免疫組化方法 嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)免疫組化染色操作步驟進(jìn)行。免疫組化染色對(duì)照：p27kip1蛋白用已知結(jié)腸癌的陽性片作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。1.4 結(jié)果判定 所有切片采用雙盲法由2位病理科專家獨(dú)立閱片。p27kip1蛋白陽性主要為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色，細(xì)胞核也可見表達(dá)。隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野（×400）并計(jì)數(shù)，每個(gè)視野至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取其平均值計(jì)算細(xì)胞陽性率，并據(jù)此對(duì)染色結(jié)果分級(jí)。參照文獻(xiàn)[5]：p27kip1蛋白陽性率＜10%為陰性（-），10%～50%為弱陽性（+），≥50%為強(qiáng)陽性（++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料的比較采用Ridit分析。

2 結(jié)果

2.1 p27kip1蛋白陽性表達(dá)情況 見圖1-2。

圖1 正常結(jié)腸組織中p27kip1蛋白表達(dá)強(qiáng)陽性（a：SP× 200；b：SP×400）

圖2 結(jié)腸癌組織中p27kip1蛋白表達(dá)陽性（a：SP×200；b：SP×400）

2.2 兩組標(biāo)本組織中p27kip1蛋白陽性表達(dá)率的比較 觀察組中陽性表達(dá)16例（40.00%），陰性表達(dá)24例（60.00%）；對(duì)照組中陽性表達(dá)15例（75.00%），陰性表達(dá)5例（25.00%）。觀察組中p27kip1蛋白陽性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 觀察組不同分化程度患者p27kip1蛋白表達(dá)的比較 見表1。

表1 觀察組不同分化程度患者p27kip1蛋白表達(dá)的比較（例）

由表1可見，高、中分化患者p27kip1蛋白的陽性表達(dá)程度明顯高于低分化患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

2.4 觀察組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移患者p27kip1蛋白表達(dá)的比較 見表2。

表2 觀察組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無轉(zhuǎn)移患者p27kip1蛋白表達(dá)的比較（例）

由表2可見，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者p27kip1蛋白的陽性表達(dá)程度明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 觀察組不同TNM分期患者p27kip1蛋白陽性表達(dá)率的比較 見表3。

由表3可見，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者p27kip1蛋白陽性表達(dá)率明顯高于Ⅲ～Ⅳ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 觀察組不同TNM分期患者p27kip1蛋白陽性表達(dá)率的比較[例（%）]

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道p27kip1蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)定位。Fan等[6]應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)109例喉鱗狀細(xì)胞癌組織中p27kip1蛋白的表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，p27kip1蛋白主要定位于細(xì)胞核，偶見胞質(zhì)或胞質(zhì)與胞核同時(shí)表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，p27kip1蛋白陽性表達(dá)主要定位于胞質(zhì)，胞核僅少部分表達(dá)，偶見胞質(zhì)與胞核同時(shí)表達(dá)，與Fan等的研究結(jié)果不符，提示p27kip1蛋白在不同細(xì)胞中的表達(dá)位置有所不同，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

p27kip1蛋白亦參與細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和凋亡，p27kip1蛋白水平的降低使得細(xì)胞凋亡減少也可能是促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。Florenes等[7]及Kuo等[8]在皮膚癌和口腔癌中同樣發(fā)現(xiàn)p27kip1蛋白的低表達(dá)水平。Sui等[9]采用免疫組化法觀察22例卵巢上皮性良性腫瘤、23例卵巢上皮性交界性腫瘤、34例卵巢上皮性惡性腫瘤中的p27kip1蛋白表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)發(fā)現(xiàn)，p27kip1蛋白與腫瘤惡性程度呈負(fù)相關(guān)，提示低p27kip1蛋白促進(jìn)卵巢上皮性腫瘤的發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p27kip1蛋白在結(jié)腸癌組織的陽性表達(dá)率顯著低于在癌旁正常結(jié)腸中的陽性表達(dá)率，提示p27kip1蛋白表達(dá)的降低可能促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展；p27kip1在高分化型結(jié)腸癌組織表達(dá)量最強(qiáng)，在低分化型結(jié)腸癌組織中表達(dá)量最弱，提示p27kip1蛋白水平的高低可能與結(jié)腸癌的細(xì)胞分化程度有關(guān)。

新近研究表明，p27kip1蛋白可增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附作用，促進(jìn)鈣粘素的叢集，而鈣粘素具有介導(dǎo)細(xì)胞間和細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附作用；同時(shí)，p27kip1蛋白可阻止正常細(xì)胞與基質(zhì)結(jié)合[10]。而調(diào)節(jié)p27kip1蛋白表達(dá)的信號(hào)可能通過改變細(xì)胞形狀或改變細(xì)胞接受胞外信號(hào)的能力而達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附作用。本研究結(jié)果顯示，觀察組中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者p27kip1蛋白的表達(dá)量低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者，表明p27kip1蛋白可能與結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。p27kip1蛋白的表達(dá)水平在結(jié)腸癌不同臨床分期上的研究國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。而在臨床上，結(jié)腸癌早期和晚期的治療方法和治療效果都相差較大，因此臨床上對(duì)結(jié)腸癌早期和晚期的診斷尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)，p27kip1蛋白在TNM分期Ⅰ～Ⅱ期（早期）中的表達(dá)量高于Ⅲ～Ⅳ期（晚期）中的表達(dá)量，表明p27kip1蛋白的表達(dá)水平可能與腫瘤的分期有關(guān)，腫瘤早期p27kip1蛋白尚有明顯表達(dá)，而腫瘤晚期p27kip1蛋白則表達(dá)不明顯。因此，p27kip1蛋白有可能作為一種臨床診斷結(jié)腸癌早期和晚期的新指標(biāo)，有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法通過對(duì)40例結(jié)腸癌組織和20例癌旁正常結(jié)腸組織的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與假設(shè)相一致，證實(shí)了p27kip1蛋白在結(jié)腸癌中的低表達(dá)，可能與結(jié)腸癌的細(xì)胞分化程度、轉(zhuǎn)移和腫瘤臨床分期有關(guān)。

綜上所述，p27kip1蛋白在結(jié)腸癌中的低表達(dá)，可能與結(jié)腸癌的細(xì)胞分化程度、轉(zhuǎn)移和腫瘤臨床分期有關(guān)。深入探討p27kip1蛋白在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，將有助于進(jìn)一步了解結(jié)腸癌的發(fā)生機(jī)制，從而為結(jié)腸癌的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，p27kip1蛋白也將成為結(jié)腸癌試驗(yàn)性基因治療的靶點(diǎn)。

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Empirical study of expression of p27kip1 proteins in carcinoma of colon

Objective To study the express of p27kip1 in carcinoma of colon，then to investigate its roles and probable mechanism in the pathogenesis of colon cancer．MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression and distribution of p27kip1 in carcinoma of colon and normal colon．Statistics was used to analyze the data．Making a analysis of positive expression level of p27kip1 protein in colon caner tissue with different degree of differentiation and lymph node metastasis．Results16 cases of positive expression of p27kip1 Protein in observation group(40%),15 cases of positive expression of p27kip1 Protein in the control group(75%),the difference was statistically significant(P＜0．05)．The expression of p27kip1 Protein in group of high degree of differentiation was significantly higher than that group of low differentiated．The difference was statistically significant(P＜0．05)．The positive expression of p27kip1 Protein in patients with the extent of lymph node metastasis was significantly lower than that in patients without lymph node metastasis,the difference was statistically significant(P＜0．05)．12 cases of positive expression of p27kip1 Protein in TNM stage I～I(xiàn)I(63．16%),4 cases of positive expression of p27kip1 Protein in TNM stageⅢ～Ⅳ(19．05%),the difference was statistically significant(P＜0．05)．Conclusionp27kip1 protein as a tumor suppressor factor that can regulate cell proliferation,differentiation and apoptosis of ability．Low expression of p27kip1 protein led to tumor occurrence and development in organization．Protein of p27kip1 would be considered as new clinical index of colon carcinoma,and make for diagnose of neoplasm differentiation,neoplasm metastasis and TNM staging．

p27kip1 Colon cancerImmunohistochemical

2013-07-26）

（本文編輯：歐陽卿）

325200 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院普外二科

張海峰，E-mail：15825618600@163.com