劉勇攀 石定 王澤軍 于香

RNA干擾技術(shù)干涉后核糖體蛋白S15a在胃癌中的表達(dá)及意義

劉勇攀 石定 王澤軍 于香

目的 探討RNA干擾（RNAi）技術(shù)干涉后核糖體蛋白S15a（RPS15a）在胃癌中的表達(dá)及意義。方法選取12例胃癌患者手術(shù)切除的胃癌組織，利用RNAi干涉RPS15a基因，將小片段克隆到質(zhì)粒中，分別提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC823。將未轉(zhuǎn)染、隨機(jī)小片段轉(zhuǎn)染非編碼序列、siRPS15a-1轉(zhuǎn)染、siRPS15a-2轉(zhuǎn)染的BGC823細(xì)胞分為BGC823-WT組、siNC組、siRPS15a-1組、siRPS15a-2組，RT-PCR法及Western blot分別檢測(cè)各組RPS15a RNA及蛋白的表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果RNAi后細(xì)胞中出現(xiàn)了明顯的綠色熒光，提示此轉(zhuǎn)染方式是可行的。轉(zhuǎn)染檢測(cè)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)提取的RNA未受到質(zhì)粒DNA的污染，可以進(jìn)行表達(dá)的比較。siRPS15a-1組、siRPS15a-2組RNA及蛋白表達(dá)相對(duì)灰度比值與BGC-WT組、siNC組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05），BGC-WT組與siNC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。RNAi后細(xì)胞增殖速度顯著下降，多數(shù)細(xì)胞集中在G0/G1期。結(jié)論RNAi技術(shù)不僅可以下調(diào)RPS15a在胃癌中表達(dá)，而且還可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖活性。

核糖體蛋白 S15a 胃癌 RNA干擾

胃癌是最主要的惡性腫瘤類型之一，分子生物學(xué)研究表明癌基因、抑癌基因和細(xì)胞周期控制基因的異常表達(dá)參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。核糖體蛋白S15a（ribosomal protein S15a，RPS15a）是核糖體蛋白家族中的一員，在蛋白質(zhì)的生物合成中起重要作用。近年來，越來越多的證據(jù)表明RPS15a除組成核糖體促進(jìn)蛋白質(zhì)的生物合成，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡外，還具有獨(dú)立于蛋白質(zhì)生物合成作用之外的功能，尤其是參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的已引起廣泛重視，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚。本研究應(yīng)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)對(duì)RPS15a的表達(dá)進(jìn)行干涉，旨在探討該基因?qū)ξ赴┌l(fā)生、發(fā)展的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 選取2006-03—06在我院接受手術(shù)治療的胃癌患者12例，男7例，女5例，年齡49～76歲，平均61.4歲。所有患者均以手術(shù)切除的癌組織及癌旁正常組織（距離癌組織約5cm）進(jìn)行對(duì)照分析，組織離體后立即在液氮中速凍，并置于-70℃冰箱中保存。

1.2 試劑和儀器 RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，熒光差異顯示試劑盒購(gòu)于Genhunter公司，SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Gibco公司，熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司。熒光差異顯示系統(tǒng)（HITACHI公司生產(chǎn)），STRATAGENE MX3000P熒光定量PCR儀（Eppendorf公司生產(chǎn)），GenspecⅢ（HITACHI公司生產(chǎn)）。RPS15a的定量PCR及內(nèi)參所選用的引物序列由Ambion公司設(shè)計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 cDNA的制備 以Trizol提取的方法提取胃癌組織、癌旁組織及細(xì)胞總RNA并純化，用MMLV反轉(zhuǎn)錄得到胃癌和癌旁組織以及胃癌細(xì)胞的cDNA。提取的總RNA進(jìn)行凝膠電泳及Gene SpecⅢ檢測(cè)。

1.3.2 熒光定量PCR分析 利用DNAstar軟件設(shè)計(jì)用于熒光定量PCR的RPS15a基因引物，內(nèi)參選用人βactin（GenBank登錄號(hào)：AK225414），檢測(cè)RPS15a基因在胃癌組織、癌旁組織中的表達(dá)差異，引物序列見表1。反應(yīng)條件為94℃40s，58℃35s，72℃40s。

表1 引物序列

1.3.3 RPS15a的RNAi、分組及表達(dá)變化的檢測(cè) 將RPS15a的序列提交到Ambion公司，由專業(yè)軟件設(shè)計(jì)了2條序列（siRPS15a-1：GCA AAC GCC AGG TGC TTA TTA；siRPS15a-2：GAT GAT GAA GCA TGG TTA CAT），以隨機(jī)小片段作為參照。RNAi的小片段也由Ambion公司合成。將小片段克隆到質(zhì)粒中，分別提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC823，通過熒光顯微鏡觀察共表達(dá)的綠色螢光蛋白，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。將未轉(zhuǎn)染、隨機(jī)小片段轉(zhuǎn)染非編碼序列、siRPS15a-1轉(zhuǎn)染、siRPS15a-2轉(zhuǎn)染的BGC823細(xì)胞分為4組，分別為BGC823-WT組、siNC組、siRPS15a-1組、siRPS15a-2組，然后從其細(xì)胞中提取RNA，采用RT-PCR進(jìn)行RPS15a表達(dá)變化的分析。

1.3.4 RPS15a蛋白水平的檢測(cè) 收集處理后的BGC細(xì)胞，提取總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)RPS15a蛋白水平。

圖2 BGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒，GFP表達(dá)檢測(cè)BGC-WT：BGC細(xì)胞未經(jīng)轉(zhuǎn)染；siNC：BGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染非編碼序列，作為陰性對(duì)照

1.3.5 RPS15a RNAi后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 收集RNAi后的RPS15a細(xì)胞，行Brdu染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化和細(xì)胞增殖的影響。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行克隆形成的比較實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在軟瓊膠的平板上生長(zhǎng)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色了解細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 RPS15a差異表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果 凝膠電泳結(jié)果顯示，

28S和18S條帶較為明顯，總RNA的完整性和質(zhì)量較好。采用Gene SpecⅢ檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)，A260/A280值均在1.9～2.0，結(jié)果與電泳結(jié)果一致，各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到反轉(zhuǎn)錄要求。對(duì)RPS15a基因在癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)量進(jìn)行熒光定量分析（見圖1），發(fā)現(xiàn)RPS15a基因在胃癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁組織。

圖1 RPS15a基因在癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況（C：胃癌組織；N：癌旁正常組織）

2.2 RPS15a的RNAi情況 RNAi后細(xì)胞中出現(xiàn)了明顯的綠色熒光（見圖2），提示此轉(zhuǎn)染方式是可行的。對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的RPS15a的檢測(cè)結(jié)果表明，直接以RNA進(jìn)行擴(kuò)增，未擴(kuò)增出條帶（見圖3），表明本實(shí)驗(yàn)提取的RNA未受到質(zhì)粒DNA的污染，可以進(jìn)行表達(dá)的比較。BGC823-WT組、siNC組、siRPS15a-1組、siRPS15a-2組RPS15a RNA表達(dá)相對(duì)灰度比值分別為（0.71±0.11）、（0.69±0.09）、（0.37±0.05）、（0.20±0.06）；siRPS15a-1組、siRPS15a-2組RNA表達(dá)相對(duì)灰度比值與BGC-WT組、siNC組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），BGC-WT組與siNC組的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。BGC-WT組、siNC組、siRPS15a-1組、siRPS15a-2組RPS15a蛋白表達(dá)檢測(cè)情況見圖4，相對(duì)灰度比值分別為（4.11±0.15）、（3.99±0.23）、（2.31±0.35）、（2.13±0.21）；siRPS15a-1組、siRPS15a-2組蛋白表達(dá)相對(duì)灰度值與對(duì)照組的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），BGC-WT組與siNC組的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 RT-PCR檢測(cè)BGC細(xì)胞RPS15a干擾效果。BGC-WT：BGC細(xì)胞未經(jīng)轉(zhuǎn)染；siNC：BGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染非編碼序列，作為陰性對(duì)照；siRPS15a-1、-2分別為BGC細(xì)胞RPS15a 1號(hào)和2號(hào)RNA干擾質(zhì)粒；RT（-）：BGC-WTRNA未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄。

2.3 RPS15a RNAi后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 Brdu染色結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖速度顯著下降（圖5）。同時(shí)細(xì)胞周期的狀態(tài)分析表明，干擾后多數(shù)細(xì)胞集中在G0/G1期，也說明了細(xì)胞生長(zhǎng)受到了抑制（圖6）。在此基礎(chǔ)上，細(xì)胞干擾后進(jìn)行了克隆形成的比較實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在軟瓊膠的平板上生長(zhǎng)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾后的細(xì)胞生長(zhǎng)慢，克隆形成較少，克隆團(tuán)也較小，而正常細(xì)胞和隨機(jī)小片段的對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)較好，克隆形成多，并且克隆團(tuán)較大（圖7）。

圖4 Western blot檢測(cè)RPS15a的表達(dá)（標(biāo)注與圖3相同）

圖5 Brdu檢測(cè)BGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染RPS15a干擾質(zhì)粒48h后增值。BGC-WT：BGC細(xì)胞未經(jīng)轉(zhuǎn)染；siNC：BGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染非編碼序列，作為陰性對(duì)照；siRPS15-1、-2分別為BGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染RPS15a 1號(hào)和2號(hào)RNA干擾質(zhì)粒。*P＜0.05，siRPS15-1、-2分別為BGC-WT和siNC比較

圖6 BGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染RPS15a干擾質(zhì)粒48h后周期分布比較。BGC-WT：BGC細(xì)胞未經(jīng)轉(zhuǎn)染；siNC：BGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染非編碼序列，作為陰性對(duì)照；siRPS15-1、-2分別為BGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染RPS15a 1號(hào)和2號(hào)RNA干擾質(zhì)粒

3 討論

RNAi是多種生物體內(nèi)由雙鏈RNA介導(dǎo)的同源mRNA降解現(xiàn)象，其本質(zhì)是siRNA與靶向mRNA特異結(jié)合、并由RISC介導(dǎo)其降解，從而阻止mRNA的翻譯，導(dǎo)致基因沉默，具有高效性、高特異性和毒性小的特點(diǎn)。隨著siRNA在活體中的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率的提高以及非特異性作用的減少，其在臨床上正迅速得到廣泛應(yīng)用。

圖7 BGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染RPS15a干擾質(zhì)粒2周后克隆形成能力比較。BGC-WT：BGC細(xì)胞未經(jīng)轉(zhuǎn)染；siNC：BGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染非編碼序列，作為陰性對(duì)照；siRPS15-1、-2分別為BGC細(xì)胞轉(zhuǎn)染RPS15a 1號(hào)和2號(hào)RNA干擾質(zhì)粒

RPS15a是高保守的核糖體蛋白，其基因位于16p13，全長(zhǎng)為7 369bp，閱讀框架編碼130個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量14 300。近來有學(xué)者在研究肝癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，RPS15a表達(dá)可被HBvX蛋白上調(diào)，而上調(diào)RPS15a可加速人肝癌細(xì)胞株HepG2的生長(zhǎng)及其在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力，提示該基因參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展[1]。Amsterdam已證實(shí)RPS15a是斑馬魚的癌基因。XU等[2]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)RPS15a表達(dá)可抑制人類體外肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，推測(cè)該基因可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起到突出作用。Coleman等[3]在采用雌二醇治療非雄激素依賴型前列腺癌的過程中發(fā)現(xiàn)，RPS15a表達(dá)下調(diào)。孟存英等[4]利用免疫組化方法研究發(fā)現(xiàn)，RPS15a在胃腺癌中表達(dá)高于癌旁組織，且隨著胃癌浸潤(rùn)深度的增加，該基因陽(yáng)性表達(dá)率也逐漸增高，提示RPS15a高表達(dá)與胃癌腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。Shen等[5]發(fā)現(xiàn)，RPS15a可與鈣調(diào)素（CaM）結(jié)合，從而發(fā)揮其核糖體裝配和翻譯過程。CaM可能通過與Ca2+的結(jié)合，在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，RPS15a在腫瘤組織中高表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)該基因可能在細(xì)胞增殖中起重要作用。運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，RPS15a在胃癌組織中表達(dá)顯著高于其所對(duì)應(yīng)的癌旁組織，這與既往研究結(jié)果是一致的，但其上調(diào)原因及在腫瘤形成中的地位目前尚不清楚。有學(xué)者認(rèn)為RPS15a高表達(dá)可能與真核起始因子4F相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，從而可能在蛋白翻譯水平上介導(dǎo)腫瘤發(fā)生[6]。也有學(xué)者認(rèn)為p53突變涉及核糖體的活性或調(diào)節(jié)功能，這也可能是RPS15a在胃癌中高表達(dá)的機(jī)制之一。

為進(jìn)一步研究RPS15a基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，筆者針對(duì)該基因mRNA設(shè)計(jì)合成2對(duì)siRNA分子（RPS15a-1 siRNA，RPS15a-2 siRNA），轉(zhuǎn)染胃癌BGC細(xì)胞，通過RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染后可顯著抑制RPS15a mRNA及蛋白的表達(dá)，證實(shí)了應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制RPS15a表達(dá)的可行性；應(yīng)用Brdu檢測(cè)48h后BGC細(xì)胞增殖情況發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了siRNA的細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染及陰性對(duì)照細(xì)胞降低，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與陰性對(duì)照細(xì)胞相比無明顯差異，這說明通過RNA干擾能有效的抑制BGC細(xì)胞增殖，可見RPS15a-1 siRNA及RPS15a-2 siRNA確實(shí)能阻斷RPS15a的表達(dá)，抑制BGC細(xì)胞增殖，一方面提示RPS15a與胃癌癌的發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后有密切的關(guān)系；另一方面提示RNA干擾可用于特異性阻斷RPS15a表達(dá)，為靶向誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為胃癌的基因治療提供了理論基礎(chǔ)。

本文結(jié)果還顯示，siRPS15a作用于胃癌BGC細(xì)胞48h后G0/G1期細(xì)胞明顯增多。腫瘤既是一類基因性疾病，也是細(xì)胞周期性疾病，幾乎所有的癌基因疾病都要涉及細(xì)胞周期機(jī)制。細(xì)胞周期有3個(gè)調(diào)控點(diǎn)，分別調(diào)控G0/G1、G1/S、G2/M。其中G0/G1、G1/S調(diào)控點(diǎn)是控制細(xì)胞周期的開始，是控制腫瘤細(xì)胞周期基因治療策略的重點(diǎn)，而G1-S轉(zhuǎn)換是細(xì)胞周期最重要的調(diào)控點(diǎn)，G1期阻滯是細(xì)胞增殖抑制的重要環(huán)節(jié)，細(xì)胞不能進(jìn)入S期，DNA合成無法完成，干擾了蛋白質(zhì)代謝，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的分裂。這說明RPS15a作用BGC細(xì)胞后使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，不能進(jìn)入S期，從而使細(xì)胞增殖抑制，促使細(xì)胞停止分裂。筆者認(rèn)為，RPS15a可能是通過影響胃癌細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，這與XU等[2]的研究結(jié)果也是一致的。在此基礎(chǔ)上，作細(xì)胞干擾后進(jìn)行了平皿克隆形成的比較實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾后的細(xì)胞生長(zhǎng)慢，克隆形成較少，克隆團(tuán)也較小，而正常細(xì)胞和隨機(jī)小片段的陰性對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)較好，克隆形成多，并且克隆團(tuán)較大。這些結(jié)果也同樣表明siRNA可明顯抑制BGC細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖。

綜上所述，運(yùn)用RNAi技術(shù)干擾RPS15a基因不僅可以下調(diào)胃癌BGC細(xì)胞其表達(dá)，而且還可以抑制胃癌BGC細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖活性。RPS15a基因是否能夠作為一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)從而被用于腫瘤的分子靶向治療，還有待于基礎(chǔ)和臨床的進(jìn)一步研究。同時(shí)，該基因的下調(diào)是否會(huì)影響正常細(xì)胞的功能，也有待于進(jìn)一步分析。

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[3]Coleman I M,Kiefery J A,Browny L G,et al．Inhibition of androgen-independent prostate cancer by estrogenic compounds is associated with increased expression of immune-related genes [J]．Neoplasia,2006,8(10)：862-878．

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Knock-down of RPS15a by siRNA inhibits proliferation of gastric cancer BGC823 cells

Objective To investigate the effects of ribosomal protein S15a (RPS15a)in proliferation of gastric cancer cell BGC823 by RNA interference technique．MethodsBGC823 cells were transfected with random non-coding sequences(siNC group),siRPS15a-1(siRPS15a-1 group)or siRPS15a-2(siRPS15a-2 group),respectively．RPS15a RNA and protein expression was detected by RT-PCR and Western Blot test,respectively;and the cell proliferation was determined by flow cytometry．ResultsThe expression levels of RPS15 in SiRPS15a-1 and siRPS15a-2 groups were significantly lower than those in non-transfected BGC823 cells (WT group)and siNC group (all P＜0．05);no significant differences was found between WT and siNC groups (P＞0．05)．Cell proliferation rate were decreased significantly in SiRPS15a-1 and siRPS15a-2 groups,and most cells were in G0/G1 phase．ConclusionRPS15a RNA interference technique inhibits cells growth,which is associated with the knock-down of RPS15a expression in BGC823 cells．

Ribosomal protein S15a(RPS15a)Gastric cancer(GC)RNA interference(RNAi)

2013-09-29）

（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

杭州市衛(wèi)生局計(jì)劃項(xiàng)目（2009B049）

311100 余杭區(qū)第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科（劉勇攀、石定、于香）；余杭區(qū)第五人民醫(yī)院（王澤軍）

石定，E-mail：shidingyuhang@163.com