透明質(zhì)酸鈉對(duì)大鼠脊髓損傷后膀胱黏膜修復(fù)的影響

諸靖宇 王彥彬 宋晨 樓揚(yáng)鋒

透明質(zhì)酸鈉對(duì)大鼠脊髓損傷后膀胱黏膜修復(fù)的影響

諸靖宇 王彥彬 宋晨 樓揚(yáng)鋒

目的 探討透明質(zhì)酸鈉對(duì)大鼠脊髓損傷后膀胱黏膜修復(fù)的影響。方法將48只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及透明質(zhì)酸鈉灌注組，每組16只。采用脊髓橫斷法建立大鼠脊髓損傷的神經(jīng)源性膀胱模型。通過(guò)觀察各組大鼠膀胱大體情況、HE染色情況、組織學(xué)損傷評(píng)分以及膀胱組織中IL-6的表達(dá)情況評(píng)估其炎癥的嚴(yán)重程度。結(jié)果正常對(duì)照組膀胱組織無(wú)明顯病理改變；模型對(duì)照組膀胱組織可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜嚴(yán)重充血、出血，上皮細(xì)胞壞死，黏膜、黏膜下層及肌層均有炎性水腫；透明質(zhì)酸鈉灌注組膀胱組織可見(jiàn)黏膜充血，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型對(duì)照組及透明質(zhì)酸鈉灌注組組織學(xué)損傷評(píng)分及膀胱組織中IL-6陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于正常對(duì)照組，透明質(zhì)酸鈉灌注組組織學(xué)損傷評(píng)分及膀胱組織中IL-6陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05或0．01）。結(jié)論透明質(zhì)酸鈉膀胱灌注可以減輕大鼠脊髓損傷后膀胱黏膜急性炎癥反應(yīng)以及促進(jìn)損傷后的膀胱黏膜修復(fù)。

透明質(zhì)酸鈉 脊髓損傷 神經(jīng)源膀胱 膀胱黏膜 修復(fù)

神經(jīng)源性膀胱是泌尿外科常見(jiàn)疾病，治療尤為困難，目前尚缺乏一種積極有效的手段來(lái)主動(dòng)保護(hù)黏膜。盡管目前關(guān)于透明質(zhì)酸鈉修復(fù)膀胱黏膜的報(bào)道已有較多，但關(guān)于透明質(zhì)酸鈉對(duì)脊髓損傷后膀胱黏膜修復(fù)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究采用脊髓橫斷法建立大鼠脊髓損傷的神經(jīng)源性膀胱模型，通過(guò)外源性補(bǔ)充透明質(zhì)酸鈉，觀察透明質(zhì)酸鈉膀胱灌注對(duì)減輕膀胱黏膜炎癥及促進(jìn)損傷后膀胱黏膜修復(fù)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 SD雌性成年大鼠48只，購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。透明質(zhì)酸鈉為杭州協(xié)合醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)[大分子量（1 650ku），濃度1%，5ml/支]，IL-6兔抗鼠多克隆抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，免疫組織化學(xué)超敏Ultra Sensitive SP試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 大鼠急性脊髓損傷模型制作[1]腹腔注射戊巴比妥鈉（25～30mg/kg）麻醉，經(jīng)背部縱行切口，切除T8和T9椎板，然后在脊髓T9節(jié)段行全橫斷術(shù)，并切除其上4mm脊髓組織，清除損傷腔內(nèi)殘留的神經(jīng)組織，在缺損腔內(nèi)植入約2mm×2mm×4mm的骨臘作為填充物。逐層縫合脊柱切口，1號(hào)絲線間斷縫合皮膚。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：切除脊髓時(shí)尾巴痙攣性擺動(dòng)，雙下肢及軀體回縮樣撲動(dòng)。大鼠脊髓損傷后立即處于脊髓休克期，部分在恥骨聯(lián)合上緣可觸及脹大的膀胱。損傷初期采用腹部按壓方式輔助排尿。術(shù)后前5d每天對(duì)造模成功大鼠按壓下腹部膀胱區(qū)輔助排尿3次，每只大鼠均單籠飼養(yǎng)。術(shù)后均連續(xù)3d腹腔注射青霉素（50 000U·kg-1·d-1）。

1.3 分組及處理方法 將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及透明質(zhì)酸鈉灌注組，每組16只。所有大鼠均用10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔內(nèi)注射法麻醉大鼠，采用3F硬膜外導(dǎo)管經(jīng)尿道插入大鼠膀胱，妥當(dāng)固定后連接好1ml注射器。正常對(duì)照組僅應(yīng)用尿道插管，并拔管，2次/周，共4周；模型對(duì)照組采用0.9%氯化鈉溶液0.5ml注入膀胱，30min后抽出液體，用0.9%氯化鈉溶液沖洗4次后拔管，2次/周，共4周；透明質(zhì)酸鈉灌注組采用透明質(zhì)酸鈉液0.5ml注入膀胱，30min后抽出，然后用0.9%氯化鈉溶液沖洗4次后拔管，2次/周，共4周。

1.4 標(biāo)本制作及結(jié)果判定 所有大鼠處理4周后24、72h各半數(shù)處死，取膀胱標(biāo)本，觀察標(biāo)本大體情況，固定后行常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，依據(jù)Iba等[2]采用的組織學(xué)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。采用高壓鍋法修復(fù)抗原，免疫組化SP三步法測(cè)定大鼠膀胱組織中IL-6的表達(dá)情況，DAB顯色，蘇木精襯染，以胞質(zhì)、胞核出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性，以細(xì)胞無(wú)棕黃色或與背景一致的淺棕色為陰性，在400倍光鏡下觀察，隨機(jī)挑選10個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，得出陽(yáng)性細(xì)胞率（陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析，組間計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠膀胱大體改變的比較 正常對(duì)照組大鼠膀胱黏膜無(wú)明顯改變；模型對(duì)照組大鼠膀胱黏膜上皮可見(jiàn)明顯潰瘍?cè)?，周圍黏膜水腫隆起，上皮可見(jiàn)廣泛的出血點(diǎn)；透明質(zhì)酸鈉灌注組黏膜上皮有少量脫落，有表淺潰瘍?cè)?，周圍黏膜輕度水腫，有散在的小出血點(diǎn)。

2.2 HE染色結(jié)果及組織學(xué)損傷評(píng)分 正常對(duì)照組無(wú)明顯病理改變（圖1a），組織學(xué)損傷評(píng)分（0.441±0.138）分；模型對(duì)照組可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜嚴(yán)重充血、出血，上皮細(xì)胞壞死，黏膜、黏膜下層及肌層均有炎性水腫（圖1b），組織學(xué)損傷評(píng)分（8.265±0.377）分；透明質(zhì)酸鈉灌注組可見(jiàn)黏膜充血，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1c），組織學(xué)損傷評(píng)分（5.492±0.241）分。模型對(duì)照組及透明質(zhì)酸鈉灌注組組織學(xué)損傷評(píng)分均顯著高于正常對(duì)照組，透明質(zhì)酸鈉灌注組組織學(xué)損傷評(píng)分明顯低于模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。2.3 3組大鼠膀胱組織免疫組化染色I(xiàn)L-6的表達(dá)情況 正常對(duì)照組IL-6低表達(dá)，著色較淺呈弱陽(yáng)性（圖2a），陽(yáng)性表達(dá)率為（13.8±3.1）%；模型對(duì)照組尿路上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的胞質(zhì)中IL-6高表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率（47.2±1.5）%；透明質(zhì)酸鈉灌注組陽(yáng)性表達(dá)率（34.4±3.7）%。模型對(duì)照組及透明質(zhì)酸鈉灌注組IL-6陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于正常對(duì)照組，透明質(zhì)酸鈉灌注組IL-6陽(yáng)性表達(dá)率模型低于模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

3 討論

脊髓損傷后患者均存在不同程度的膀胱功能障礙，可誘發(fā)一系列的泌尿系并發(fā)癥，如尿路感染、神經(jīng)源性膀胱、尿失禁，以及更嚴(yán)重的腎積水、腎功能衰竭。而神經(jīng)源性膀胱的治療往往從患者脊髓損傷恢復(fù)后期才開(kāi)始，總是在肢體康復(fù)之后，此時(shí)的膀胱黏膜屏障破壞嚴(yán)重[3-4]，引起尿路感染的因素持續(xù)存在，往往需要長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素，難以達(dá)到最佳療效，且容易產(chǎn)生耐藥菌。

有學(xué)者報(bào)道認(rèn)為，尿路上皮表面存在葡萄糖胺基聚糖層，它可以阻止細(xì)菌團(tuán)塊、致炎物質(zhì)、致癌物質(zhì)等黏附至膀胱黏膜表面，當(dāng)各種原因使此保護(hù)機(jī)制受到破壞時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致膀胱黏膜損傷，使得各種損傷因子包括細(xì)菌團(tuán)塊、尿液中各種離子等接觸到膀胱黏膜下層，進(jìn)而引起一系列病理變化，包括各種炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、間質(zhì)水腫、細(xì)胞增生等[5-6]。葡萄糖胺聚糖（glucosaminoglycam，GAG）的一個(gè)基本組成成分是透明質(zhì)酸，透明質(zhì)酸鈉是透明質(zhì)酸的鈉鹽形式，透明質(zhì)酸鈉可以對(duì)膀胱上皮細(xì)胞的GAG層缺損進(jìn)行修復(fù)，阻止了毒性物質(zhì)透過(guò)滲透性屏障損害肌層。近年來(lái)，透明質(zhì)酸鈉膀胱灌注是臨床一大熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外有較多文獻(xiàn)報(bào)道[7-10]，但大都局限于間質(zhì)性膀胱炎、腺性膀胱炎或放射性膀胱炎等，有關(guān)透明質(zhì)酸鈉對(duì)大鼠脊髓損傷后膀胱黏膜修復(fù)的影響，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)有報(bào)道。

圖1 3組大鼠膀胱標(biāo)本HE染色結(jié)果（a：正常對(duì)照組；b：模型對(duì)照組；c：透明質(zhì)酸鈉灌注組；×100）

圖2 3組大鼠膀胱組織免疫組化染色I(xiàn)L-6表達(dá)情況（a：正常對(duì)照組；b：模型對(duì)照組；c：透明質(zhì)酸鈉灌注組；×400）

IL-6是一種具有多向調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，參與機(jī)體的炎癥應(yīng)答及自身免疫應(yīng)答過(guò)程，在機(jī)體多種生理或病理?xiàng)l件下都發(fā)揮著重要作用[11]。本研究結(jié)果表明，IL-6也可在正常尿路上皮中表達(dá)，但陽(yáng)性較弱；在模型對(duì)照組中，大鼠膀胱黏膜尿路上皮細(xì)胞及間質(zhì)中的血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞及肥大細(xì)胞均有IL-6的較強(qiáng)表達(dá)；與模型對(duì)照組比較，透明質(zhì)酸鈉灌注組IL-6的表達(dá)減少。另外，透明質(zhì)酸鈉灌注組的組織學(xué)損傷評(píng)分及IL-6的表達(dá)均明顯低于模型對(duì)照組，證明使用透明質(zhì)酸鈉膀胱灌注可以減輕膀胱黏膜的炎癥反應(yīng)或增強(qiáng)膀胱黏膜的修復(fù)功能。然而，關(guān)于脊髓損傷后透明質(zhì)酸鈉膀胱灌注減輕膀胱黏膜炎癥反應(yīng)的機(jī)制尚不完全明確。目前較成熟的觀點(diǎn)認(rèn)為，膀胱表面GAG層的缺陷將導(dǎo)致膀胱上皮缺損，進(jìn)而改變尿路上皮對(duì)尿液成分的通透性，使尿液中的細(xì)菌、微晶體、蛋白和離子等毒性物質(zhì)進(jìn)入膀胱肌層，引起膀胱炎癥[12-13]。也有學(xué)者認(rèn)為，若有害物質(zhì)進(jìn)入黏膜下層，便會(huì)刺激膀胱間質(zhì)、致使肥大細(xì)胞激活，釋放組胺，引起膀胱炎癥[14]。

綜上所述，透明質(zhì)酸鈉灌注對(duì)膀胱黏膜具有一定的保護(hù)作用，這為脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱炎的預(yù)防及治療提供一條全新的思路，但其確切作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。由于透明質(zhì)酸鈉具有無(wú)抗原性、無(wú)致敏性、無(wú)致熱源性等特點(diǎn)[15]，膀胱灌注時(shí)損傷小、并發(fā)癥少、操作簡(jiǎn)單易推廣，將具有廣泛的應(yīng)用前景。

[1]David B T,Steward O．Deficits in bladder function following spinal cord injury vary depending on the level of the injury[J]．Exp Neurol, 2010,226(1)：128-135．

[2]Iba Y,Sugimoto Y,Kamei C,et al．Possible role of mucosal mast cells in the recovery process of colitis induced by dextran sulfate sodiumin rats[J]．Int Immunopharmacol,2003,3(4)：485-491．

[3]柯麗,沈杰吳,立華．神經(jīng)源性膀胱的康復(fù)治療[J]．安徽醫(yī)學(xué),2010,31 (3)：290-291．

[4]Grover S,Srivastava A,Lee R,et al．Role of inflammation in bladder function and interstitial cystitis[J]．Therapeutic Advances in Urology,2011,3(1)：19-33．

[5]Sun Y,Chai T C．Effects of dimethyl sulphoxide and heparin on stretch-activated ATP release by bladder urothelial cells from patientswith interstitial cystitis[J]．BJU,2002,90(4)：381-385．

[6]Nickel J C,Barkin J,Forrest J,et al．Randomized,double-blind, dose-ranging study of pentosan polysulfate sodium for interstitial cystitis[J]．Urology,2005,65(4)：654-658．

[7]楊進(jìn)益,魏偉,葉林,等．膀胱水?dāng)U張后透明質(zhì)酸鈉灌注治療間質(zhì)性膀胱炎療效分析[J]．中華泌尿外科雜志,2012,33(3)：219-222．

[8]杜鵬,喬永忠,朱緒輝,等．膀胱灌注透明質(zhì)酸鈉治療間質(zhì)性膀胱炎的臨床研究[J]．中華泌尿外科雜志,2009,30(9)：599-601．

[9]Figueiredo A B,Palma P,Riccetto C,et al．Clinical and urodynamic experience with intravesical hyaluronic acid in painful bladder syndrome associated with interstitial cystitis[J]．Actas Urol Esp, 2011,35(3)：184-187．

[10]Sommariva M L,Sandri S D,Ceriani V．Efficacy of sodium hyaluronate in the management of chemical and radiation cystitis [J]．Minerva Urol Nefrol,2010,62(2)：145-150．

[11]Daha L K,Lazar D,Simak R,et al．Is there a relation between urinary interleukin-6 levels and symptoms before and after intra-vesicalgly cosaminoglycan substitution therapy in patients with bladder pain syndrome/interstitial cystitis[J]?Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct,2007,18(12)：1449-1452．

[12]De Vita D,Antell H,Giordano S．Effectiveness of intravesical hyaluronic acid with or without chondroitin sulfate for recurrent bacterial cystitis in adult women：a meta-analysis[J]．Int Urogynecol J,2013,24(4)：545-552．

[13]De Vita D,Giordano S．Effectiveness of intravesical hyaluronic acid/chondroitin sulfate in recurrent bacterial cystitis：a randomized study[J]．Int Urogynecol J,2012,23(12)：1707-1713．

[14]Leppilahti M,HellstrOm P,Tammela T L．Effect of diagnostic hydrodistension and four intravesical hyaluronan instiilations on bladder ICAM-l intensity and association of ICAM-1 intensity with clinical response in patients with interstitial cystitis[J]．Urology,2002,60：46-51．

[15]溫世和,陳劍平,歐陽(yáng)少青,等．膀胱水?dāng)U張聯(lián)合灌注透明質(zhì)酸鈉治療間質(zhì)性膀胱炎的臨床分析[J]．中華腔鏡泌尿外科雜志(電子版),2011,5 (3)：228-230．

Intravesical infusion of sodium hyaluronate enhances bladder mucosal repairing after spinal cord injury in rats

Objective To investigate the effect of sodium hyaluronate on bladder mucosal repair after spinal cord injury in rats．MethodsForty eight rats were randomly divided into 3 groups with 16 in each．No any treatment for rats in group A(normal control);neurogenic bladder model of spinal cord injury was induced with spinal cord transection in groups B (model group)and C(treatment group),then rats in group C was intravesically infused with sodium hyaluronate．The severity of inflammation in bladder mucosa was evaluated by HE staining,histological injury score and IL-6 expression．ResultsLight microscope showed large number of inflammatory cell infiltration,significant expansion of capillary,epithelial cell necrosis in group B;less inflammatory cell infiltration and capillary dilatation in group C．Histological injury score in group B was significantly higher than that in group C(P＜0．05)．The expression of IL-6 in group A was significantly lower than that in groups B and C(P＜0．01);while IL-6 expression in group C was lower than that in group B(P＜0．05)．ConclusionIntravesical infusion of sodium hyaluronate can relieve acute inflammation and enhance the repairing of bladder mucosa in rats after spinal cord injury．

Sodium hyaluronate Spinal cord injury Neurogenic bladderBladder mucosa Repair

2013-11-11）

（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)臨床科研基金項(xiàng)目（2011ZYC-A36）

310009 杭州市第三人民醫(yī)院泌尿外科