安梨皮渣中總黃酮微波輔助提取工藝優(yōu)化

崔蕊靜，劉秀鳳，常學(xué)東*

（河北科技師范學(xué)院 食品科技學(xué)院，河北 秦皇島 066004）

安梨（Pyrus ussuriensis）俗稱酸梨，是冀東北、京、津、遼西等地燕山山脈的栽培品種之一，其營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特。現(xiàn)市場上安梨加工品品種較少，但目前河北省燕山地區(qū)安梨的年產(chǎn)量近3 000萬kg，若用來加工，約有2 000萬kg果肉可加工安梨酒、安梨醋、安梨膏、安梨茶等新型加工品，約有600～900萬kg皮渣產(chǎn)生，安梨皮渣大多被當(dāng)作肥料、飼料甚至垃圾處理，附加值很低。安梨中黃酮類物質(zhì)含量較高，具有抗氧化、降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、預(yù)防心血管疾病、抗衰老、抗自由基和抗癌、防癌及增強免疫能力等藥理作用[1-3]。從藥用植物中提取具有生理活性的黃酮作為天然藥物、保健品和化妝品等行業(yè)的原料，已日益引起重視。因此，黃酮類化合物的提取和分離方法也將得到更加深層次的研究和開發(fā)，已有的方法將會日趨成熟和完善，各種高效、方便快捷的新方法將會不斷涌現(xiàn)[4]。微波處理因促進反應(yīng)的高效性、強選擇性、操作簡便、副產(chǎn)物少、產(chǎn)率高及產(chǎn)物易提純等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[5-8]。本研究采用乙醇溶液作浸提劑對安梨皮渣進行微波處理，探討微波輔助處理對安梨皮渣中黃酮類物質(zhì)的浸提特性影響，旨在為安梨皮渣黃酮類物質(zhì)提取工藝的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

安梨皮渣：河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院試驗室提供；蘆丁對照品：中國藥品生物制品鑒定所，批號100080- 200808；硝酸鋁、亞硝酸鈉、乙醇、氫氧化鈉、丙酮、甲醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 設(shè)備與儀器

723型紫外/可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司分光儀總廠；WD900B微波爐：順德市格蘭仕電器實業(yè)有限公司；JFSD-70粉碎機：上海嘉定糧油儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DHG-9245A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 測定方法

采用分光光度法。先用蘆丁對照品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，于波長510 nm處比色定量測定，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)樣品的吸光度計算黃酮類物質(zhì)含量，再調(diào)整各種因素，求出最佳試驗條件[9-10]。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[11-13]

本試驗采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法對提取液的黃酮含量進行測定，通過與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度值進行對比，得到提取液內(nèi)的黃酮類物質(zhì)含量，計算得率。稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用體積分數(shù)50%的乙醇定容至50 mL容量瓶中，搖勻，得到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL分別置于10 mL比色管中，加蒸餾水4 mL，向各管加入質(zhì)量分數(shù)5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻放置6 min；向各管加入質(zhì)量分數(shù)10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻放置6 min；向各管加入質(zhì)量分數(shù)4%的NaOH 溶液2.0 mL，搖勻，用蒸餾水定容至10 mL，放置20 min，以蒸餾水為空白對照，于波長510 nm 處測定標(biāo)準(zhǔn)蘆丁的吸光度值。

1.3.3 安梨皮渣中黃酮類物質(zhì)的提取與測定

稱取樣品150 g于燒杯中，加入150 mL蒸餾水，然后放入打漿機中打漿。打漿結(jié)束后用紗布過濾得到濾液，準(zhǔn)確量取濾液的總體積。準(zhǔn)確量取濾液2 mL于100 mL三角瓶中，在濾液中加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液，搖勻，微波提取，冷卻至室溫。再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算提取液中黃酮含量。

本試驗采用蘆丁含量表征試樣中總黃酮物質(zhì)的含量，在測出樣品的吸光度值后，根據(jù)回歸方程計算蘆丁含量，再根據(jù)如下公式計算總黃酮得率。

式中：C為相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量濃度，g/L；V0為測定吸光度值時所用樣液的體積，mL；V1為測定時樣液稀釋的體積；V2為樣液定容的體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 安梨皮渣中黃酮類物質(zhì)提取單因素試驗

預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，確定影響黃酮類物質(zhì)得率的單因素試驗的基本參數(shù)為料液比、乙醇體積分數(shù)、微波功率、微波處理時間。分別變動基本參數(shù)中的單一因素，檢測相應(yīng)條件下的黃酮類物質(zhì)得率，考察單因素變化對黃酮類物質(zhì)得率的影響。

1.3.5 安梨皮渣中黃酮類物質(zhì)提取正交試驗設(shè)計

以料液比、微波處理時間、微波功率、乙醇體積分數(shù)作為安梨總黃酮得率的考察因素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以安梨總黃酮得率為指標(biāo)，按表1采用L9（34）正交試驗設(shè)計對安梨總黃酮提取工藝進行優(yōu)化，每個水平3 次重復(fù)，取平均值。

表1 黃酮物質(zhì)提取條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for flavonoid extraction conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為x軸、吸光度值為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，并得到回歸方程，所得回歸方程為y=11.369x+0.009 2，其線性范圍為0～0.1 mg，相關(guān)系數(shù)0.999 3。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 安梨皮渣總黃酮提取的單因素試驗

2.2.1 料液比對總黃酮得率的影響

量取安梨皮渣濾液6份，每份2 mL，分別置于100 mL三角瓶中，按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（mL∶mL）的比例混合體積分數(shù)50%乙醇提取劑，在微波功率為360 W條件下浸提3 min，按照“1.3.3”的方法測定各提取液吸光度值，計算不同料液比中總黃酮得率。

圖2 不同料液比對總黃酮得率的影響Fig.2 Effects of different solid to liquid ratio on total flavonoid yield

由圖2可以看出，安梨皮渣中總黃酮得率隨料液比中乙醇的增加逐漸提高，在料液比為1∶10（mL∶mL）時得率達到最大值，主要的原因是提取劑比例的提高，增加了料液體系與提取劑體系間有效成分的濃度差，也減少了物料內(nèi)部有效成分的殘留量，從而提高得率；再增加料液比時，總黃酮得率反而下降。究其原因，可能是提取劑對微波能的吸收增加，導(dǎo)致細胞液對微波能吸收減少，細胞破裂不完全，安梨總黃酮不能被充分溶出。同時增加提取劑比例會增加溶劑的用量，也會加大后續(xù)處理工序的投入成本。對不同處理的總黃酮得率進行方差分析，F(xiàn)=15.75＞F0.01（5，12）=5.06，說明料液比對總黃酮得率存在極顯著差異。因此料液比不超過1∶10（mL∶mL）為宜。

2.2.2 微波處理時間對總黃酮得率的影響

安梨皮渣濾液中，按1∶10（mL∶mL）的比例加入體積分數(shù)50%乙醇提取劑，在微波功率為360 W條件下分別浸提2 min、3 min、4 min、5 min、6 min，其余條件同“2.2.1”。

圖3 不同提取時間對總黃酮得率的影響Fig.3 Effects of different extraction time on total flavonoid yield

由圖3可以看出，微波處理時間＜3 min時，總黃酮得率不斷增加，處理時間＞3 min后總黃酮含量反而下降。這可能是由于微波短時間處理對物料細胞膜的破壞作用較小，總黃酮浸出量少，隨著時間延長，微波對植物細胞強烈的破壁作用及加快萃取組分的分子由物料內(nèi)部擴散到萃取溶劑界面的速度，所以總黃酮浸出量增多，但隨時間繼續(xù)延長，細胞膜進一步破裂，當(dāng)總黃酮溶解度達飽和時，有效成分不再被溶出，且物料中粘液質(zhì)及其他雜質(zhì)被溶出，使浸出液黏度增大，從而擴散速度變慢，后續(xù)工序過濾變得困難，且隨時間增加，可能使黃酮類化合物被破壞。對不同處理的總黃酮得率進行方差分析，F(xiàn)=32.41＞F0.01（4，10）=5.99，說明微波處理時間對總黃酮得率存在極顯著差異。綜合各考慮，確定微波處理時間為3 min。

2.2.3 微波功率對總黃酮得率的影響

安梨皮渣濾液中，按1∶10（mL∶mL）的比例加入體積分數(shù)乙醇提取劑，在不同的微波功率180 W、360 W、540 W、720 W、900 W條件下浸提3 min，其余條件同“2.2.1”。

從圖4可以看出，隨著微波功率的增加總黃酮得率也增加，當(dāng)超過一定功率時，總黃酮含量降低。這可能是因為當(dāng)微波功率較低時，微波對細胞膜的破壞作用較小，分子運動不劇烈，故總黃酮浸出量較低；隨著微波功率不斷增加，微波對細胞的破壁作用和加熱作用，加速了細胞內(nèi)有效成分的快速溶出，總黃酮浸出量隨之增加；但當(dāng)微波功率過大時，使乙醇暴沸蒸發(fā)較多，造成提取液不能很好的與物料接觸，提取劑不能有效的進入細胞，且黃酮類化合物熱穩(wěn)定性差，在較高功率條件下結(jié)構(gòu)被破壞，雜質(zhì)溶出也較多，使黃酮浸出率降低。對不同處理的總黃酮得率進行方差分析，F(xiàn)=22.67＞F0.01=5.06，說明微波功率對總黃酮得率存在極顯著差異。綜合考慮浸提效果和成本，確定微波功率為360 W。

圖4 不同微波功率對總黃酮得率的影響Fig.4 Effects of different microwave power on total flavonoid yield

2.2.4 乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率的影響

安梨皮渣濾液中，按1∶10的比例分別加入不同體積分數(shù)（0、15%、30%、50%、70%、90%）的乙醇溶液作提取劑，在微波功率為360 W條件下浸提3 min，其余條件同“2.2.1”。

圖5 不同乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率的影響Fig.5 Effects of different ethanol concentration on total flavonoid yield

由圖5可以看出，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，總黃酮得率也隨之升高，在乙醇體積分數(shù)為50%時達到最大值；繼續(xù)增加乙醇體積分數(shù)，安梨總黃酮得率反而下降，這可能與微波加熱的機理有關(guān)，提高乙醇體積分數(shù)可以增加提取劑對物料的滲透性，并可提高黃酮類化合物的溶解度，從而提高安梨總黃酮的得率。但在使用微波加熱時，物料中的極性分子尤其是水分子吸收微波能，因為水的介電常數(shù)比乙醇大，更易吸收微波，產(chǎn)生大量熱量而使物料升溫，乙醇體積分數(shù)增加減小了料液中水的比例，使物料升溫減慢，從而影響得率。另外，乙醇體積分數(shù)過高會使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固，而葉綠素等脂溶性物質(zhì)的溶出量增多，從而導(dǎo)致黃酮類化合物的浸出率下降[14-15]。對不同處理的總黃酮得率進行方差分析，F(xiàn)=14.32＞F0.01=5.06，說明乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率存在極顯著差異。綜合考慮，乙醇體積分數(shù)為50%為宜。

2.3 微波提取安梨皮渣總黃酮工藝的優(yōu)化

單因素試驗基礎(chǔ)上，對影響安梨皮渣黃酮類物質(zhì)得率的主要因素料液比、提取時間、微波功率、乙醇體積分數(shù)進行L9（34）正交試驗，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 黃酮物質(zhì)提取條件正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for flavonoid extraction conditions optimization

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test results

對表2中的結(jié)果進行極差分析可知，各因素對安梨總黃酮得率影響的主次順序為C＞A＞D＞B，即微波功率對得率影響最大，料液比和乙醇體積分數(shù)次之，而微波提取時間影響較小。最佳提取工藝條件為A1B2C2D2，即料液比1∶10（mL∶mL），提取時間3 min，微波功率360 W，乙醇體積分數(shù)50%，總黃酮得率最高達0.210%。由表3可知，四因素的F均大于F0.01，說明各因素對安梨皮渣總黃酮得率均存在極顯著的影響。

3 結(jié)論

微波輔助提取安梨皮渣總黃酮的適宜工藝條件是料液比1∶10（mL∶mL），微波處理時間3 min，微波功率360 W，乙醇體積分數(shù)50%，總黃酮類得率最高達0.210%。本試驗優(yōu)化了安梨皮渣黃酮類物質(zhì)的提取工藝，提高黃酮類物質(zhì)的得率。

試驗中采用的安梨皮渣是濕品，故造成黃酮類物質(zhì)得率低，若采用經(jīng)烘干的安梨皮渣干品，會使工藝延長，耗能加大。

微波輔助提取安梨皮渣黃酮類物質(zhì)，與傳統(tǒng)浸提法相比較，微波法的提取時間較短，速度快，節(jié)約能源，是一種比較理想的提取安梨總黃酮的方法。

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