食品中蠟樣芽孢污染特點(diǎn)及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

伊 鋆，酈 娟，董 玲，楊 永*

（武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，湖北武漢 430014）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，B.c）自從1950年被Hauge氏首次報(bào)道其能引起食物中毒以來(lái)，就一直為學(xué)者們所廣泛關(guān)注[1]。劉秀梅等[2]的研究表明，2005年微生物造成的食源性疾病中由B.c引起的占8.9%。王洋等[3]總結(jié)了1947～2010年有文獻(xiàn)報(bào)道的11例B.c嘔吐型死亡案例，中國(guó)有6例，可見(jiàn)B.c食物中毒在我國(guó)危害性很大。

鑒于B.c污染與人們?nèi)粘ｏ嬍辰】迪⑾⑾嚓P(guān)，且在一定條件下會(huì)造成嚴(yán)重危害，本文綜述了幾類常見(jiàn)食品被B.c污染的特點(diǎn)，并總結(jié)了國(guó)內(nèi)外學(xué)者最新研究的檢測(cè)及控制蠟樣芽孢的手段，為有針對(duì)性地監(jiān)測(cè)并控制幾類食品中的污染提供參考，最大限度避免因B.c污染帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失以及健康損害。

1 易污染產(chǎn)品

1.1 糧食制品

由于我國(guó)的氣候特點(diǎn)為南方溫暖潮濕，北方夏秋季節(jié)室溫較高，且主食為面食或米飯，又有吃隔夜米飯等生活習(xí)慣，使B.c的污染變得不容忽視。周幗萍等[4]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在引發(fā)嘔吐型食物中毒的食品中，糧食加工品占非常大的比例，其中米飯及其制品約占81.1%，面制品約占10.1%，而在腹瀉型B.c食物中毒中，糧食加工品占約30%的比例。近幾年國(guó)內(nèi)報(bào)道的各類糧食制品中B.c污染狀況見(jiàn)表1。

表1 糧食制品中蠟樣芽孢桿菌污染狀況Table 1 Contamination conditions of B.cereus in cereal products

由表1可以看出，對(duì)米面制品進(jìn)行統(tǒng)一抽檢分析的報(bào)告結(jié)果顯示，污染率基本在4%～15%，污染率相對(duì)較低；針對(duì)米粉、米線、米飯進(jìn)行專項(xiàng)抽檢的結(jié)果顯示污染率相對(duì)較高，這可能與抽檢樣品量及代表性有關(guān)，但報(bào)告均未能指出具體的陽(yáng)性樣品污染濃度；在針對(duì)嬰幼兒輔助食品的調(diào)查中，各份調(diào)查采樣量相對(duì)充足，但檢出率相差較大。

1.2 含乳制品

乳制品在加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)均易受蠟樣芽孢桿菌污染，康博燕等[16]在研究酸奶生產(chǎn)環(huán)境中芽孢桿菌污染狀況時(shí)發(fā)現(xiàn)，外包裝車間存在蠟樣芽孢污染的狀況。在奶制品中的污染情況的研究較多，據(jù)報(bào)道在我國(guó)巴氏殺菌乳春季檢出率超過(guò)70%[17]，冰淇淋中達(dá)60%[18]。近幾年我國(guó)4類含乳制品中蠟樣芽孢桿菌的污染狀況見(jiàn)表2。

表2 含乳制品中蠟樣芽孢桿菌污染狀況Table 2 Contamination conditions of B.cereus in milk products

從表2可以看出，原料乳的污染率基本為20%～35%，檢出量較高，均已超過(guò)103CFU/mL；乳粉的污染率在7.5%～35%，四份調(diào)查結(jié)果相差較大可能與抽檢產(chǎn)品品牌有關(guān)，其中兩份調(diào)查報(bào)告中未能提供具體檢出量，從已知的報(bào)告中可以看出，乳粉中總體污染量維持在較低水平；對(duì)于巴氏殺菌乳及冰淇淋近年的抽查報(bào)告報(bào)出較少，單從引用報(bào)告結(jié)果看，兩種產(chǎn)品檢出率都很高，但污染濃度相對(duì)較低。

1.3 豆類食品

豆制品制作工藝復(fù)雜，如加工環(huán)境不衛(wèi)生或在運(yùn)輸和存儲(chǔ)過(guò)程中不注意控制溫度容易導(dǎo)致豆制品被蠟樣芽孢桿菌污染。在我國(guó)已經(jīng)有因?yàn)槎節(jié){[25]，豆制品（小食品）[26]被污染引起的集體中毒事件。幾類常見(jiàn)豆制品的污染狀況見(jiàn)表3。

表3 豆制品中蠟樣芽孢桿菌污染狀況Table 3 Contamination conditions of B.cereus in soybean products

由表3可以看出，發(fā)酵豆制品污染濃度相對(duì)較高。其中3份黃豆醬陽(yáng)性樣本污染量達(dá)到了103CFU/g；19個(gè)腐乳樣品中有2個(gè)樣品達(dá)到106CFU/g；有16個(gè)腐乳樣品的污染量超過(guò)了103CFU/g；豆豉的調(diào)查表明雖然檢出率比較高，但陽(yáng)性樣本的幾何均數(shù)檢出率均＜1 100 CFU/g。

1.4 其他類食品

除以上總結(jié)的三大類易污染產(chǎn)品外，國(guó)內(nèi)外不斷有研究報(bào)道被蠟樣芽孢桿菌污染的其他產(chǎn)品。楊紅紅等[31]通過(guò)16S rDNA序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定了B.c是導(dǎo)致桶裝番茄醬脹袋的腐敗菌之一。楊松等[32]對(duì)錦州市3個(gè)區(qū)超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的新鮮海產(chǎn)品、海產(chǎn)干品、進(jìn)行芽抱桿菌污染情況調(diào)查，海產(chǎn)干5份檢樣中有4份檢出，檢出量達(dá)到103～105CFU/g。黃結(jié)等[33]確認(rèn)有12批保健食品被檢出B.c，其中螺旋藻片和鈣片檢出率分別為60.0%和21.1%。

2 檢測(cè)方法研究進(jìn)展

2.1 常規(guī)培養(yǎng)法

常規(guī)蠟狀芽孢桿菌檢測(cè)方法主要通過(guò)特異性平板甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂選擇性分離，這種方法靈敏度高，專一性較強(qiáng)，但在區(qū)分蕈狀芽孢桿菌時(shí)，需要在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)數(shù)天觀察根狀生長(zhǎng)狀況，檢驗(yàn)周期較長(zhǎng)。KIM D H等[34]研制的新型蠟樣芽孢計(jì)數(shù)培養(yǎng)基以馬血為基礎(chǔ)，加入卵黃、多粘菌素B等成分，與MYP相比，可以在樣品中背景菌較多的情況下很好地突出目標(biāo)菌；盧勉飛等[35]研制的B.c顯色培養(yǎng)基HKMCB選擇的是具有高特異性的磷脂酶，與MYP相比可以直接從菌落顏色區(qū)分蕈狀芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌。

2.2 核酸分析方法

近年來(lái)，學(xué)者們圍繞與蠟狀芽孢桿菌致病相關(guān)的4個(gè)基因hbl、nhe、cytK和ces采用PCR法實(shí)現(xiàn)了對(duì)B.c毒株的快速檢驗(yàn)。PCR方法在高通量檢測(cè)及鑒定致病菌方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，表4列出了近幾年具有代表性的研究成果。其中，THAPA S P等[39]以cytK為靶基因，采用多重PCR方法，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)包括蠟樣芽孢桿菌在內(nèi)的5中食源性致病菌的目標(biāo)。CREMONESI P等[43]采用實(shí)時(shí)定量PCR方法以ces為靶基因，更實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)包括蠟樣芽孢桿菌內(nèi)的23中常見(jiàn)食源性致病菌。KIM J M等[37，41]則從區(qū)分致病及非致病性入手，分別采用mPCR和qPCR方法實(shí)現(xiàn)了蠟樣芽孢桿菌的快速檢測(cè)。ZHANG Z H等[38]將核酸交聯(lián)染料技術(shù)與多重PCR方法相結(jié)合，在滿足區(qū)分致病及非致病性蠟樣芽孢的前提下，消除了死菌DNA擴(kuò)增信號(hào)對(duì)PCR擴(kuò)增的影響，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蠟樣芽孢活菌的檢測(cè)。MARTíNEZ-BLANCH JF等[42]利用RT-qPCR方法檢測(cè)蠟樣芽孢磷酯酰膽堿特異性磷酯酶mRNA，實(shí)現(xiàn)了對(duì)活菌的定量檢驗(yàn)，在人工污染的樣品中檢出限可以達(dá)到1.1×104CFU/mL。

此外，為了縮短檢驗(yàn)周期，周巍等[44]采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）檢測(cè)方法，將酸乳經(jīng)前增菌后提取DNA進(jìn)行分析，此方法特異性良好，以蘇云金芽孢桿菌DNA擴(kuò)增也并無(wú)條帶出現(xiàn)，檢出限為6.4 CFU/mL，人工污染的檢出限可以達(dá)到21 CFU/mL，實(shí)現(xiàn)了縮短了檢測(cè)時(shí)間的目的。

表4 mPCR和qPCR方法檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌常用引物Table 4 Common used primers for detection of B.cereus by mPCR and qPCR

2.3 現(xiàn)代儀器分析方法

隨著儀器制造業(yè)及信息技術(shù)的飛速發(fā)展，光譜、色譜、質(zhì)譜以及各類生物傳感器都開始在微生物鑒定方面有所應(yīng)用。萬(wàn)佳蓉等[45]采用傅里葉變換紅外光譜非破壞性地分析B.c，結(jié)果表明，根據(jù)二階導(dǎo)數(shù)光譜特征吸收峰可區(qū)分B.c細(xì)胞的莢膜、芽孢、貯能物質(zhì)等特殊結(jié)果物質(zhì)。鄭秋月等[46]利用變性高效液相色譜分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）區(qū)分蠟樣芽孢桿菌不同長(zhǎng)度DNA片段產(chǎn)生的特異峰形分析其gyrB基因，數(shù)百個(gè)樣本分析可以在一天完成。在FERNáNDEZ-NO I C等[47]采用微生物的鑒定領(lǐng)域今年發(fā)展起來(lái)的新型分析測(cè)試手段MALDI-TOF MS方法對(duì)收集到的57株芽孢桿菌進(jìn)行分型，結(jié)果表明該方法可以有效區(qū)分芽孢桿菌，尤其可以很好地將B.c與解淀粉芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌區(qū)分開。KANG X B等[48]采用殼聚糖作為交聯(lián)劑制作的雙層納米金電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)蠟樣芽孢的檢出限可以達(dá)到10.0 CFU/mL，靈敏度在5.0×101～5.0×104CFU/mL（R=0.996 6）范圍內(nèi)。喻勇新等[49]采用金屬氧化物氣敏傳感器檢測(cè)了TSB培養(yǎng)液中的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，可以鑒別出B.c、單增李斯特菌、緩慢葡萄球菌。

3 結(jié)語(yǔ)

目前國(guó)際上許多國(guó)家都已經(jīng)將B.c檢測(cè)納入乳制品檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，但我國(guó)還沒(méi)有把蠟樣芽孢及其毒素作為一種常規(guī)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目來(lái)對(duì)待。盡管B.c腹瀉型食物中毒不會(huì)造成致死性傷害，但是嘔吐型食物中毒帶來(lái)的死亡事件不應(yīng)該被忽視。在研究食品中蠟樣芽孢桿菌污染狀況時(shí)還存在一些問(wèn)題。

首先，在監(jiān)測(cè)過(guò)程中應(yīng)擴(kuò)大采樣量及產(chǎn)品類別，且監(jiān)測(cè)的結(jié)果分析中應(yīng)更多關(guān)注具體污染濃度，輔助毒力基因分析結(jié)果，以全面了解蠟樣芽孢的污染狀況。在避免源頭污染的同時(shí)，尤其應(yīng)關(guān)注散裝的、保質(zhì)期時(shí)間長(zhǎng)的、適于低溫保存的、真空包裝產(chǎn)品的污染狀況。有些調(diào)查研究在4年甚至4年后才整理出版，缺乏實(shí)效性，急需構(gòu)建全國(guó)范圍內(nèi)的網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，及時(shí)公布調(diào)查研究結(jié)果，為以后監(jiān)測(cè)方向提供參考。其次，各類新的快速檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際樣品檢測(cè)中還存在檢出限較高的問(wèn)題，且實(shí)驗(yàn)人工污染樣品主要為乳制品，種類單一很難普及應(yīng)用到所有食品檢驗(yàn)中。開發(fā)快速、準(zhǔn)確、高通量且能區(qū)分活菌的檢測(cè)方法仍然是今后的熱點(diǎn)研究方向。最后，今后在蠟樣芽孢桿菌污染的檢測(cè)方向方面是否需要監(jiān)測(cè)其毒素產(chǎn)生狀況及監(jiān)測(cè)毒力基因攜帶情況，或者監(jiān)測(cè)方向是否應(yīng)該監(jiān)測(cè)蠟樣芽孢桿菌族在食品中污染狀況，才能更有效地避免給商家?guī)?lái)經(jīng)濟(jì)損失，減少給人們身體健康帶來(lái)?yè)p害，是很值得監(jiān)管部門深思的問(wèn)題。

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