六味地黃湯及其水提醇沉物對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響

戴 冰， 邢 瑞， 周方亮， 肖子曾*， 黃開顏， 楊賽男， 冷 旺

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 湖南 長沙 410007； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)， 湖南 長沙 410007）

六味地黃湯及其水提醇沉物對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響

戴 冰1， 邢 瑞2， 周方亮2， 肖子曾2*， 黃開顏1， 楊賽男2， 冷 旺2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 湖南 長沙 410007； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)， 湖南 長沙 410007）

目的 觀察六味地黃湯及其水提醇沉物對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響。方法 采用高脂喂養(yǎng)加腹腔注射鏈脲佐菌素 （STZ） 的方法建立 2 型糖尿病大鼠模型。 設(shè)空白組、 模型組、 二甲雙胍組、 六味地黃湯組、 六味地黃湯水提醇沉物組， 模型組和空白組給予等量生理鹽水， 給藥 30 d， 測各組大鼠空腹血糖值 （FBG）、 酶聯(lián)免疫法 （ELLSA） 測定大鼠血清胰島素 （INS） 水平并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù) （HOMA-IR） 與胰島素敏感性指數(shù) （ISI）。 結(jié)果 模型大鼠 FBG≥16.7 mmol/L， 六味地黃湯及其水提醇沉物均能降低 2 型糖尿病大鼠 FBG值及 INS 水平， 降低 HOMA-IR值， 升高 ISI值。 結(jié)論 六味地黃湯可以改善 2 型糖尿病大鼠胰島素抵抗， 其水提醇沉物可能是其改善胰島素抵抗干預(yù)2型糖尿病的藥效物質(zhì)之一。

六味地黃湯；水提醇沉物；2型糖尿??；大鼠；胰島素抵抗

隨著生活水平的日漸提高， 糖尿病 （ Diabetesmellitus，DM） 已成為當(dāng)今世界繼腫瘤、 心腦血管病之后的第三大危害人類健康的慢性疾?。?］， 我國糖尿病患者也迅猛增加，其中 90% ～95%是 2 型糖尿病［2］。 其主要病理機(jī)制是胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞功能障礙。糖尿病屬于中醫(yī)消渴的范疇，而六味地黃方是治療陰虛型消渴的代表方。大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，六味地黃方可以改善2型糖尿病，但其作用機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并不明確。本實(shí)驗(yàn)就六味地黃湯及其水提醇沉物對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響進(jìn)行研究，以探討其干預(yù)2型糖尿病的作用機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 80 只 SPF級雄性 SD大鼠， 體質(zhì)量 180 ～220 g， 由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司 （許可證號：SCXK湘 2011-0003） 提供， 動(dòng)物合格證號： 4304700293。

1.1.2 藥物 六味地黃方配伍： 熟地黃 24 g， 山茱萸 12 g， 山藥12 g， 牡丹皮9 g， 澤瀉9 g， 茯苓9 g。 藥材由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。

1.1.3 試劑 磷酸氫二鈉 （批號為 101125）， 枸櫞酸 （批號 為 100823 ）， 鏈 脲 佐 菌 素 （ STZ， Sigma， 批 號 為329A021， 購 自 Sigma 公 司 ）， 水 合 氯 醛 （ 批 號 為20100430）。

1.1.4 儀器 穩(wěn)豪倍易型血糖儀及血糖試紙 （美國強(qiáng)生公司）； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （上海亞榮生化儀器廠）； TD4-Ⅱ型臺式自動(dòng)平衡離心機(jī) （長沙平凡儀表有限公司）； MK3 型酶標(biāo)分析儀 （美國）。

1.2 方法

1.2.1 藥物及制備［3］稱取六味地黃方生藥材 10 付， 共750 g， 先浸泡 30 min， 再煎 2 次， 每 次 30min， 合并藥液后水浴濃縮為質(zhì)量濃度 1.915 g/mL的六味地黃湯。 取適量濃縮后的六味地黃湯， 70%乙醇醇沉處理， 靜置 24 h 后真空抽濾，醇溶上清液水浴濃縮，水提醇沉物最終質(zhì)量濃度為 11.326 g/mL。

1.2.2 高脂飼料的制備 高脂飼料配方［4］： 普通飼料70%、 豬油 10%、 蔗糖 15%、 牛膽酸鈉 0.5%、 膽固醇2.5%、 食鹽 2%。 由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物部加工。

1.2.3 動(dòng)物模型復(fù)制 80 只大鼠隨機(jī)分為空白組 （6 只）和造模組 （74 只）， 分別用普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng) 4 周后， 所有動(dòng)物禁食 12 h， 造模組腹腔注射 STZ 45 mg/kg，空白組腹腔注射等體積枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液， 72 h 后檢測大鼠空腹血糖 （FBG） ≥16.7 mmol/L［5］者即為 2 型糖尿病模型大鼠。

1.2.4 分組給藥 造模成功的 2 型糖尿病大鼠隨機(jī)分為六味地黃湯組 ［6.75 g/（kg·d）］、 六味地黃湯水提醇沉物組［6.75 g/（kg· d）］、 二甲 雙胍組 ［112.5 mg/（ kg· d）］、模型組， 每組 14 只， 連續(xù)灌胃 30 d， 模型組給等體積生理鹽水， 給藥劑量按照 70 kg成人與 200 g大鼠體表面積折算。

1.2.5 標(biāo)本 采 集 大 鼠 禁 食 10 h， 測 FBG后 腹 腔 注 射10%水合氯醛 0.35 g/kg麻醉， 解剖， 腹 主動(dòng)脈取 血 ， 靜置1 h后分離血清， -20 ℃凍存待檢。

1.2.6 指標(biāo)檢測 用 ELLSA法測大鼠空腹血清胰島素（FINS） 水平， 并計(jì)算胰島素抗抵指數(shù) （HOMA-IR）， 胰島素敏感性指數(shù) （ISI）。 HOMA-IR=FINS ×FBG/22.5， ISI= Lnl/（FBG×FINS）［6］。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 16 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及單因素方差分析， 組間比較采用 LSD檢驗(yàn)， 所有數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差 （） 表示。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 模型組大鼠與空白組比， FBG、 FINS、HOMA-IR明顯上升， ISI明顯下降 （P＜0.01） 且 FBG≥16.7 mmol/L， 表明 2 型糖尿病大鼠模型復(fù)制成功且模型穩(wěn)定， 胰島素敏感性降低，發(fā)生了胰島素抵抗；給藥各組與模型組比，大鼠 FBG、 FINS、 HOMA-IR值明顯下降 （P＜0.05）， ISI值明顯上升，表明二甲雙胍、六味地黃湯及其水提醇沉物都能降低2型糖尿病大鼠空腹血糖，改善胰島素抵抗，但均不能恢復(fù)到正常水平， 與空白組比， 差異顯著 （P＜0.05）； 六味地黃湯及其水提醇沉物組大鼠與二甲雙胍組比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）， 表明六味地黃湯及其水提醇沉物對 2 型糖尿病大鼠血糖及胰島素抵抗的干預(yù)作用與二甲雙胍沒有差異；六味地黃湯水提醇沉物組與六味地黃湯組比較， FBG值與 ISI值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）， 表明六味地黃湯水提醇沉物降低 2型糖尿病大鼠空腹血糖、提高胰島素敏感性的效果，優(yōu)于六味地黃湯。 見表1。

表 1 給藥后各組大鼠 FBG、 FINS、 HOM A-IR、 ISI值比較

3 討論

胰島素抵抗 （IR） 是胰島素作用的靶器官對胰島素作用的敏感性下降，即正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)。 IR是 2 型糖尿病的主要病機(jī)， 也是心血管疾病、血脂代謝紊亂等多種疾病的共同發(fā)病機(jī)制，是這些疾病的重要危險(xiǎn)因素［7］。

改善 IR是治療以上疾病的關(guān)鍵， 對 IR模型的研究是相關(guān)疾病的研究的基礎(chǔ)?，F(xiàn)用于胰島素抵抗研究的動(dòng)物模型， 多采用高脂喂養(yǎng)加小劑量 STZ或四氧嘧啶［8］的方法建立 2 型糖尿病胰島素抵抗大鼠模型［9］， 高脂喂養(yǎng)采用高脂飼料［10］或高脂乳 灌 胃［11］的 方 法， STZ采 用 尾靜脈注射［12］或腹腔注射的方法。因尾靜脈注射操作難度較大，本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)加腹腔注射 STZ的方法建立 2 型糖尿病胰島素抵抗大鼠模型。然預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)參照大部分文獻(xiàn)腹腔注射 30［13］、 35［14］mg/kg STZ誘導(dǎo)的 2 型糖尿病大鼠成模率較低，且模型不穩(wěn)定，成模大鼠血糖在一定時(shí)間內(nèi)下降，本實(shí)驗(yàn)參照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果給予大鼠腹腔注射 STZ45 mg/kg的劑量， 模型組大鼠成模后血糖 （20.39 ±2.75） mmol/L， 成模率 93%， 造模后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)一個(gè)月后血糖 （22.00 ± 2.76） mmol/L， 模型穩(wěn)定。 但高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠有拒食的現(xiàn)象， 體瘦明顯， 給 STZ成模后體瘦虛弱， 死亡率高。我們前期用高脂乳灌胃加腹腔注射 STZ的 2 型糖尿病大鼠模型， 在給 STZ后成活率高。 所以 2 型糖尿病胰島素抵抗大鼠的最佳造模方法，高脂乳喂養(yǎng)加腹腔注射45 mg/kg STZ。

六味地黃是補(bǔ)陰劑的代表方，出自宋錢乙的 《小兒藥證直訣》， 組方為熟地黃、 山茱萸、 山藥、 澤瀉、 牡丹皮、茯苓。主治腎陰虛證，是治療消渴癥腎陰虛型治療的首選，現(xiàn)代藥理及臨床研究都表明其可以干預(yù)2型糖尿病。水提醇沉是提取苷類成分的常用方法，六味地黃湯水提醇沉物是其水煎液經(jīng) 70%乙醇醇沉處理得到的， 其中的主要成分可能是六味地黃方的苷類成分： 芍藥苷［15］、 馬錢苷［16］、 莫諾苷等［17］； 本研究發(fā)現(xiàn)六味地黃湯及其水提醇沉物能明顯降低2型糖尿病大鼠血糖、胰島素水平，改善其胰島素抵抗，且其水提醇沉物組降低血糖、提高胰島素敏感性效果更優(yōu)。故六味地黃湯可能是通過改善胰島素抵抗從而干預(yù)2型糖尿病，該水提醇沉物可能是其降糖、降低胰島素水平、改善胰島素抵抗的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。然后從實(shí)驗(yàn)大鼠的體質(zhì)量數(shù)據(jù)及外表體征來看，比較給藥各組大鼠體質(zhì)量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但水提醇沉物組大鼠體瘦、陰虛癥狀較為明顯，健康狀況并沒有得到更好地改善，其原因可能是水提醇沉法會使藥物中的蛋白質(zhì)及多糖類等營養(yǎng)成分溶出，減弱了六味地黃湯改善陰虛癥狀的作用。

［ 1］ 楊德朝.糖尿病患者尿微量清蛋白/尿肌酐比值的臨床意義［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床， 2012， 9 （1）： 125-126.

［ 2 ］ YangW， Lu J， Weng J， etal.Prevalence of Diabetes among men and women in China［ J］ .N Engl J Med， 2010， 362（12）： 1090-1101.

［3］ 戴 冰，蔣冰倩，肖子曾， 等.六味地黃湯及其水提醇沉提取物對 2 型糖尿病腎陰虛證大鼠環(huán)磷酸腺苷的影響［J］.中國生化藥物雜志， 2012， 33（5）： 634-636.

［4］ 薄海美，田春雨，李繼春.銀耳多糖對實(shí)驗(yàn)性 2型糖尿病大鼠胰島 素抵抗的影 響［ J］.時(shí)珍國醫(yī) 國藥， 2011， 22（8）： 1926-1927.

［5］ 張新杰，劉建坤，高冬梅，等.吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對2 型糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用［J］.中國病理生理雜志， 2012， 28（10）： 1807-1811.

［6］ 于 丹，謝海龍，齊鳳琴，等.參葛降糖膠囊抗糖尿病作用的實(shí)驗(yàn)研究［ J］ .中醫(yī)藥學(xué)報(bào)， 2012， 40（3） ： 50-52.

［7］ 金智生，汝亞琴，李娟娥.紅芪多糖對實(shí)驗(yàn)性大鼠糖尿病胰島素抵抗瘦素的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010， 8（10）： 1215-1217.

［8］ 陳嘉斌，柴可夫，張副興， 等.活血益氣法對氣滯血瘀證2 型糖尿病大鼠治療的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011， 29（10）： 2228-2230.

［ 9］ 徐淑云， 陳 修.藥理試驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京： 人民衛(wèi)生出版社， 2002： 1519.

［10］ 張汝學(xué)， 賈正平， 劉景龍， 等.地黃寡糖對 2 型糖尿病大鼠肝臟糖代謝關(guān)鍵酶活性及基因表達(dá)的影響［J］.中草藥，2012， 43（2）： 316-319.

［11］ 龐宗然， 蘇曉慧， 劉祖涵， 等.菩人丹超微粉對 T2DM大血管病變大鼠主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2011， 38（10）： 1923-1925.

［12］ 陳 雨， 鄭少雄， 郝 杰， 等.白介素 6 在 2 型糖尿病大鼠胰島素 抵抗中的作 用［ J］.中國 臨床醫(yī)學(xué)， 2011， 18（1）： 32-34.

［13］ 馮 艷.靈芝多糖對 2 型糖尿病大鼠心肌組織氧化應(yīng)激的影響［ J］ .藥學(xué)與臨床研究， 2012， 20 （5） ： 410-413.

［14］ 付德榮， 劉承宜， 李鵬博， 等.有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合谷氨酰胺補(bǔ)充對 T2DM大鼠血清 GLP-1、 胰 島素及血糖 水平的影響［J］.體育學(xué)刊， 2012， 19（6）： 132-138.

［15］ 李向陽， 屠萬倩.RP-HPLC法測定六味地黃丸中丹皮酚、芍藥苷和烏蘇酸［J］.中成藥， 2012， 34（2）： 277-282.

［16］ 段 彬， 魏玉輝.HPLC法同時(shí)測定六味地黃丸中3 種成分含量［ J］ .臨床合理用藥雜志， 2012， 5（11） ： 66-67.

［17］ 戴 冰， 肖子曾， 劉 磊， 等.六味地黃丸入血成分莫諾苷對大鼠前脂肪細(xì)胞增殖與分化的影響［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)， 2007， 12（11）： 1245-1249.

R285.5

： B

： 1001-1528（2014）03-0608-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.036

2013-02-16

湖 南 省 自 然 科 學(xué) 基 金 項(xiàng) 目 （ 13JJ3096 ） ； 長 沙 市 科 技 局 項(xiàng) 目 （ K1106040-31 ） ； 湖 南 省 科 學(xué) 技 術(shù) 廳 科 技 計(jì) 劃 項(xiàng) 目（2010FJ4091）； 湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金項(xiàng)目 （11K046）

戴 冰 （1964—） ， 女， 主任藥師， 教授， 主要從事中藥藥理學(xué)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。 Tel： 15973157636， E-mail： db0223 @163.com

*通信作 者： 肖 子 曾 （ 1959—） ， 男， 教 授， 主 要 從 事 方 劑 的 配 伍 理 論 及 藥 理 作 用 研 究。 Tel： 13574801749， E-mail： xiaozz573 @126.com