響應(yīng)面法篩選杜仲的鹽制工藝

鄧 翀， 宋小妹， 董媛媛， 張亞強(qiáng)

（陜西中醫(yī)學(xué)院， 陜西 咸陽(yáng) 712046）

響應(yīng)面法篩選杜仲的鹽制工藝

鄧 翀， 宋小妹， 董媛媛， 張亞強(qiáng)

（陜西中醫(yī)學(xué)院， 陜西 咸陽(yáng) 712046）

目的 以多指標(biāo)結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)篩選杜仲鹽制工藝。方法 以總黃酮、總木脂素、總多糖、出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)， 采用多指標(biāo)綜合評(píng)分結(jié)合 Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)考察不同烘制時(shí)間、 烘制溫度、 加鹽量對(duì)杜仲中各化學(xué)成分的影響； 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析， 篩選杜仲鹽制工藝。 結(jié)果 響應(yīng)面回歸方程預(yù)測(cè)并優(yōu)選杜仲的鹽制工藝為烘制溫度 140 ℃， 烘制時(shí)間 35 min， 每 100 g藥材加鹽量 5 g。 結(jié)論 Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)合多指標(biāo)綜合評(píng)分優(yōu)選杜仲鹽制工藝， 從化學(xué)成分整體角度出發(fā)，優(yōu)選的工藝更具有科學(xué)性和合理性，為杜仲鹽制工藝的建立提供參考。

杜仲； 鹽制； Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)； 綜合評(píng)分

杜 仲 為 杜 仲 科 植 物 Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹(shù)皮，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)骨、益腰膝等功效。其化學(xué)成分包括木脂素類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、 多糖及多種氨基酸等化學(xué)成分［1］。歷代應(yīng)用均強(qiáng)調(diào)炮制后入藥，傳統(tǒng)炮制方法炙、炒是為了 “斷絲”， 以利于調(diào)配、 煎煮和粉碎； 鹽炙引藥入腎，直達(dá)下焦，溫而不燥，補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、 安胎作用增強(qiáng)［2］。 查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)鹽制杜仲的炮制工藝參數(shù)差別較大且缺乏科學(xué)全面的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，有必要對(duì)鹽制杜仲炮制工藝系統(tǒng)研究，規(guī)范杜仲鹽制工藝。 本實(shí)驗(yàn)采用 Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)合多指標(biāo)綜合評(píng)分篩選杜仲的鹽制工藝參數(shù)，旨在為規(guī)范鹽制杜仲飲片規(guī)格和鹽制飲片臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 試藥 杜仲藥材 （略陽(yáng)縣嘉木杜仲產(chǎn)業(yè)有限公司）； 蘆丁 （0080-9705）、 松脂醇二葡萄糖苷（ 111537-200502 ） 、 D-無(wú) 水 葡 萄 糖 （ 110833-200503）對(duì)照品均來(lái)自中國(guó)藥品生物制品檢定所（均供含量測(cè)定用）； 水為純凈水； 其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 UV1102 紫外分光光度計(jì) （上海天美儀器有限公司）； FA2004N電子分析天平 （上海天美儀器有限司）；HH-2 型電熱恒溫水浴鍋 （北京科偉永興儀器有限公司）； CS1012A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（中國(guó)重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司）； SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵 （鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備

2.1.1 各對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取蘆丁對(duì)照品 約 14.5 mg， 松 脂 醇 二 葡 萄 糖 苷對(duì) 照 品4.43 mg， D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品 17 mg， 前兩者以無(wú)水乙醇溶解，葡萄糖以純凈水溶解，分別定容于25 mL量瓶中。

2.1.2 供試液的制備 精密稱取炮制品粉末約1 g，用30 mL 70%的乙醇回流兩次， 每次1 h，過(guò)濾， 合并濾液于80 ℃水浴蒸干， 用70%乙醇溶解，定容于25 mL量瓶中， 于 4 ℃冷藏待測(cè) （出膏率、總黃酮、 總木脂素的測(cè)定）［3-4］。

精密稱取炮制品粉末 （過(guò) 60 目篩） 約 2 g，以 10 倍量 80%的乙醇回流 1 次， 每次 1 h， 濾渣用 10 倍量80%的乙醇洗滌 2 次； 濾渣以 6 倍量純凈水85℃水浴回流2 次， 每次 1 h，過(guò)濾， 濾渣和燒瓶用10 mL熱水洗滌 2 次，每次 5 mL，將過(guò)濾液于25 m L量瓶中， 用純凈水定容， 即得各供試品溶液 （適用于多糖的測(cè)定）［5］。

2.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)測(cè)定方法建立

2.2.1 出膏率的測(cè)定方法 取提取液 5mL置于已恒重的蒸發(fā)皿中80 ℃水浴蒸干， 于105 ℃恒重4 h后，放置干燥器中至室溫時(shí)稱其質(zhì)量，用其質(zhì)量減去原蒸發(fā)皿的質(zhì)量，即為5 mL提取液的膏重， 計(jì)算出膏率。

2.2.2 總黃酮測(cè)定方法 取蘆丁對(duì)照品溶液各1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0 mL于 25 m L量瓶中，各加水至 6 mL，加 5%的亞硝酸鈉溶液 0.2 mL，搖勻， 靜置 6 min； 加 10%的硝酸鋁溶液 0.2 mL搖勻， 靜置 6 min； 加 10%的氫氧化鈉溶液 4 mL，搖勻， 用純凈水定容至 25 mL， 以純凈水做空白，于 510 nm處測(cè)其吸光度［6］。 以吸光度 （A） 為縱坐標(biāo)， 質(zhì)量濃度 （C） 為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果為 A=8.586 2C+0.030 2， r=0.999 9， 表明蘆丁在 0.023 2 ～0.069 6 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

分別考察總黃酮測(cè)定方法的精密度、樣品穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率等項(xiàng)，符合方法學(xué)考察要求［4］。

2.2.3 總木脂素測(cè)定方法 取松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品溶液各 0.3、 0.5、 0.7、 0.9、 1.1 mL于 10 m L試管中， 依次加入 10%的變色酸液 1 m L， 搖勻， 加3 m L濃硫酸， 用純凈水定容至 10 mL， 沸水浴 30 min， 流水冷卻， 于 571 nm處測(cè)其吸光度，以純凈水做空白［7］。以吸光度 （A） 為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度 （C） 為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 結(jié)果為 A= 34.009C+0.0441， r=0.999 5， 表明松脂醇二葡萄糖苷在5.316 ～19.492 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

分別考察總木脂素測(cè)定方法的精密度、樣品穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率等項(xiàng)，符合方法學(xué)考察要求［3］。

2.2.4 總多糖的測(cè)定方法 取 D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液各 0.25、 0.3、 0.4、 0.45、 0.5 mL于 10 m L試管中， 各加水至2 mL起， 加 5%的苯酚溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）1 mL， 搖勻， 迅速加入濃硫酸 5 mL，用純凈水定容至10 mL試管中， 用玻璃棒攪勻后置80 ℃水浴 20 min， 取出冰水浴 5 min［5］， 以純凈水做空白， 于 480 nm處測(cè)其吸光度。 以吸光度 （A）為縱坐標(biāo)， 質(zhì)量濃度 （C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 結(jié)果為 Y=24.34C-0.144 7， r=0.999 2。 表明 D-無(wú)水葡萄糖在 0.017 ～0.034 mg/m L范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

分別考察多糖測(cè)定方法的精密度、樣品穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率等項(xiàng)，符合方法學(xué)考察要求。

2.3 多指標(biāo)綜合評(píng)分方法建立 以總黃酮、 總木脂素、總多糖、出膏率綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為： 滿分為 1， 總黃酮權(quán)重系數(shù)為 0.3、 總木脂素權(quán)重系數(shù)為 0.3、 總多糖權(quán)重系數(shù)為 0.2； 出膏率權(quán)重系數(shù)為 0.2。 綜合評(píng)分 （A） =測(cè)定總黃酮量/測(cè)定總黃酮最大值 ×0.3+測(cè)定總木脂素量/測(cè)定總木脂素最大值 ×0.3+測(cè)定總多糖量/測(cè)定總多糖最大值 ×0.2+出膏率值/最大出膏率值 ×0.2。

2.4 烘制工藝研究方案 參考文獻(xiàn)［8-11］， 選擇杜仲炮制工藝考察因素為烘制溫度、烘制時(shí)間、加鹽量。 采用 Design Expert8.05 軟件的 Box-Behnken設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1， 共設(shè)計(jì) 17 組烘制實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。

表 1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察因素與水平編碼Tab.1 Factors and levels Box-Behnken RSM test

3 結(jié)果

3.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

3.1.1 鹽制工藝綜合評(píng)分回歸模型的建立 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和所測(cè)成分含有量綜合評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)見(jiàn)表 2。 采用 Design Expert8.05 軟件對(duì)表 2 中各組綜合評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸和二項(xiàng)式分析，建立杜仲鹽制工藝綜合評(píng)分 （Y） 對(duì) 3 個(gè)因素 （X1、 X2、X3） 的二次回歸模型方程為 Y=0.77-0.065 × X1+0.002567 ×X2+0.055 ×X3-0.077 ×X1× X2-0.093 ×X1×X3+0.036 ×X2×X3-0.061 ×-0.078 ×+0.002514 ×。

表 2 綜合評(píng)分的 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results for response surface analysis

3.1.2 方程的顯著性檢驗(yàn) 對(duì)綜合評(píng)分 （A） 對(duì) 3個(gè)因素的回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。方差分析表明，模型的 F=7.15 （P=0.0084，P＜0.01）， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差較小， 模型的失擬項(xiàng) F= 1.76 （P=0.2931， P＞0.05）， 說(shuō)明失擬項(xiàng)誤差對(duì)模型沒(méi)有顯著性影響，模型擬合合理。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著分別是一次項(xiàng) X1，交互項(xiàng) X2X3， 二次項(xiàng)表 明 考 察 因 素 對(duì) 綜 合 評(píng) 分 的 影 響 不僅存在線性關(guān)系，還有交互綜合影響。模型的相關(guān)系數(shù)平方為 0.901 9， 表 明該模型比較準(zhǔn)確 地體現(xiàn)鹽制杜仲化學(xué)成分綜合評(píng)分與烘制溫度、烘制時(shí)間和加鹽量的關(guān)聯(lián)，可以采用該回歸方程對(duì)杜仲鹽制工藝進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。

表3 提取回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis for the regression m odel established

3.2 最佳工藝條件預(yù)測(cè) 通過(guò)回歸模型方程的預(yù)測(cè)， 得出杜仲鹽制工藝條件為烘制溫度 140.03 ℃，烘制時(shí)間 35.57 min，每 100 g藥材加鹽量 4.96 g?？紤]到實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)操作，將提取工藝參數(shù)修正為烘制溫度為 140 ℃， 時(shí)間 35min， 每 100 g藥材加鹽量5 g。

3.3 試驗(yàn)驗(yàn)證 采用篩選的工藝參數(shù)烘制杜仲進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，采用工藝篩選中各指標(biāo)所測(cè)最大值為參照，把驗(yàn)證試驗(yàn)各指標(biāo)實(shí)測(cè)值帶入綜合評(píng)分計(jì)算公式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5次實(shí)測(cè)綜合評(píng)分平均值為0.822 1， 預(yù)測(cè)綜合評(píng)分值為 0.837 7， 兩者標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.862%。驗(yàn)證綜合評(píng)分值與理論預(yù)測(cè)值吻合程度良好。

4 討論

4.1 文獻(xiàn)報(bào)道杜仲鹽制烘制工藝多以多糖、 總木脂素為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，本實(shí)驗(yàn)以多指標(biāo)綜合評(píng)分為指標(biāo)，從整體角度反映烘制因素差異導(dǎo)致化學(xué)組分變化，能夠更客觀、科學(xué)的評(píng)價(jià)杜仲鹽制工藝。在文獻(xiàn)查閱的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選擇烘制溫度、烘制時(shí)間和加鹽量為考察因素， 采用 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)篩選鹽制杜仲的烘制工藝，篩選出的烘制工藝為烘制溫度 140.03 ℃， 烘制時(shí)間 35.57 min，每 100 g藥材加鹽量 4.96 g。

4.2 目前關(guān)于鹽制工藝研究報(bào)道主要通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［8-11］， 而正交試驗(yàn)存在只能給出因素水平組合，無(wú)法找出整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法，將考察因素與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系用多項(xiàng)式擬合，建立考察因素與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系函數(shù)模型，可對(duì)函數(shù)的面進(jìn)行分析，研究因子與響應(yīng)值之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，并進(jìn)行優(yōu)化，最終篩選和預(yù)測(cè)最佳的工藝參數(shù)。

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Response surfacemethod for salt-water processing Eucommia ulmoides

DENG Chong， SONG Xiao-mei， DONG Yuan-yuan， ZHANG Ya-qiang
（ShaanxiUniversity of ChineseMedicine， Xianyang 712046， China ）

Eucommia ulmoides； salt-water processing； Box-Behnken experiment design；comprehensive evaluation

R283

： A

： 1001-1528（2014）03-0585-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.030

2013-05-15

陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （2010JQ4022）； 陜西省教育廳自然科學(xué)專項(xiàng) （2010JK501）

鄧 翀 （1978—）， 博士， 副教授， 研究方向： 中藥炮制化學(xué)及炮制原理。 Tel： （029） 38185165， E-mail： fmmudz217@126.com