三叉苦中6種成分比較研究

楊樹娟， 余 玲， 康國嬌， 周海瑜， 楊增明，2*

（1.云南良方傣藥研發(fā)技術(shù)中心， 云南 昆明 650217； 2.昆明貝葉傣醫(yī)藥研究所， 云南 昆明 650217）

［飲片炮制］

三叉苦中6種成分比較研究

楊樹娟1， 余 玲1， 康國嬌1， 周海瑜1， 楊增明1，2*

（1.云南良方傣藥研發(fā)技術(shù)中心， 云南 昆明 650217； 2.昆明貝葉傣醫(yī)藥研究所， 云南 昆明 650217）

目的 比較6種成分在中國南方不同產(chǎn)地、不同季節(jié)、不同部位三叉苦樣品中的分布情況。方法 樣品用甲醇回流提取， 采用 HPLC法測定， 以乙腈 -0.1%磷酸溶液為流動相， 梯度洗脫， 檢測波長為 246、 330、 285 nm。 結(jié)果6 種成分分離度良好， 檢測限低， 在線性范圍內(nèi)各成分均呈良好的線性關(guān)系， r＞0.999 7， 平均回收率為 97.84%～100.61%， RSD為1.12% ～3.89%。 結(jié)論 來自9 個產(chǎn)地的32 個不同季節(jié)、 不同部位樣品中， 6 種成分的含有量差異很大， 相對而言吳茱萸春的分布最廣， 在云南景谷和金平產(chǎn)三叉苦中含有量較高， 特別是葉， 其他依次為 7-去甲基軟木花椒素和 3-異戊烯基傘形花內(nèi)酯， 3，7-二甲氧基山柰酚和 3，7，3'-三甲氧基槲皮素， 芝麻素僅分布在云南西雙版納產(chǎn)三叉苦葉中。

傣藥； 三叉苦； 芝麻素； 7-去甲基軟木花椒素； 3-異戊烯基傘形花內(nèi)酯； 吳茱萸春

目前，已有一些關(guān)于三叉苦不同產(chǎn)地、不同部位化學(xué) 成 分 比 較 的 研 究 報(bào) 道［3-5］。 但 是， 不 同 產(chǎn)地、不同部位三叉苦化學(xué)成分差異及其與臨床應(yīng)用的關(guān)系，尚需深入研究。同時，為尋找專屬性強(qiáng)、與功能主治緊密相關(guān)的成分，用于藥材和制劑的質(zhì)量控制，本實(shí)驗(yàn)選擇1個生物堿類成分吳茱萸春（1）、2 個香豆素類成分 7-去甲基軟木花椒素 （2）和 3-異戊烯基傘形花內(nèi)酯 （3）、 2 個黃酮類成分3，7-二甲氧基山柰酚 （4） 和 3，7，3'-三甲氧基槲皮素 （5）、 1 個木脂素類成分芝麻素 （6）， 作為代表性成分， 采用 HPLC法， 對 6 種成分在不同產(chǎn)地、不同季節(jié)和不同部位三叉苦中的分布進(jìn)行了全面的定量比較研究，為三叉苦有效部位、有效成分研究和藥材標(biāo)準(zhǔn)研究及其進(jìn)一步研究與開發(fā)等工作奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Waters Acquity-UPLC （ H-Class） 高 效 液 相 色譜儀， PDA Detector， Empower Chemstation； MS105電子天平 （梅特勒-托利多）。 6 種對照品均為自制， 經(jīng) MS、1H-NMR、13C-NMR等確定結(jié)構(gòu)， HPLC檢查面積歸一化法計(jì)算純度均在 97%以上。 乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

在 9 個不同產(chǎn)地采集了 11 個樣品 （S1 ～S11）， 共分作 32 個研究用樣品，產(chǎn)地、部位和采樣日期 （批號的6位數(shù)字依次為采樣年份、 月份、日期） 見表3， 所有樣品均經(jīng)昆明植物研究所雷立功研究員鑒定為 Evodia lepta （Spreng.） Merr.。憑證標(biāo)本 （標(biāo)本號 1201） 存放于昆明貝葉傣醫(yī)藥研究所。將采集的三叉苦樣品各部位分開，葉陰干，其余切段或片，曬干，粉碎成粗粉，備用。

2 方法

2.1 色 譜 條 件 Agilent ZORBAX SB-C18色 譜 柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動相為乙腈 -0.1%磷酸溶液， 梯度洗脫 （0 ～25 min， 35%乙腈； 25 ～27 min， 35% ～42% 乙 腈； 27 ～60 min，42%乙腈）； 吳茱萸春的檢測波長為 246 nm， 芝麻素為 285 nm， 其余均為 330 nm， 同時開啟 190 ～400 nm紫外光譜檢測； 體積流量 1 mL/min， 柱溫30 ℃， 進(jìn)樣量 10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 分別取吳茱萸春、 7-去甲基軟木花椒素、 3-異戊烯基傘形花內(nèi)酯、 3，7-二甲氧基山柰酚、 3，7，3'-三甲氧基槲皮素、 芝麻素 6種對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成單個對照品溶 液 母 液， 質(zhì) 量 濃 度 依 次 為 1.008、2.562、2.520、 1.015、 1.029、 5.000 mg/mL， 分 別 精 密量取1mL， 混合， 稀釋至10mL， 即得混合對照品溶液母液。

2.3 供試品溶液的制備 取樣品粗粉約2 g， 精密稱定， 置 250 mL具塞錐形瓶中， 精密加入甲醇100 mL， 稱定質(zhì)量， 回流提取60 min， 放冷， 再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液 75 mL， 減壓濃縮至近干， 加甲醇使溶解并稀釋至適宜濃度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系、 檢測限和定量限考察 取混合對照品溶液母液， 分別稀釋 0、 10、 100、 300 倍， 在10、 6、 5、 3、2 μL間， 分別精密吸取適量進(jìn)樣檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以信噪比 s/n 約為 10 時的進(jìn)樣量為定量限，s/n 約為 3時為檢測限，結(jié)果見表1。

BIM技術(shù)的高效應(yīng)用對建筑工程項(xiàng)目信息管理具有重大影響。新時期，建筑工程人員只有明確BIM技術(shù)在項(xiàng)目信息管理中應(yīng)用的必要性，并在把握其具體應(yīng)用特征的基礎(chǔ)上，做好其在文檔信息管理、成本信息管理和進(jìn)度信息管理等方面的具體應(yīng)用，才能保證BIM技術(shù)應(yīng)用水平的提升，進(jìn)而推動建筑工程項(xiàng)目信息管理的進(jìn)一步發(fā)展。

表1 對照品的線性關(guān)系和線性范圍Tab.1 Linear relationship and linear range of references

2.5 精密度試驗(yàn) 取 “2.4” 項(xiàng)下稀釋 10 倍的混合對照品溶液， 按 “2.1” 項(xiàng)下的色譜條件， 連續(xù)進(jìn)樣6 次， 結(jié)果 6 種化合物的峰面積的 RSD依次為 1.10%、 0.58%、 0.61%、 0.93%、 1.13%、1.54%， 表明儀器和方法的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取混勻的樣品 S5-3 粗粉 6 份，按 “2.3”項(xiàng)下的方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件檢測。 結(jié)果 6 種化合物的峰 面 積 的 RSD 依 次 為 2.1%、 2.7%、 2.6%、1.9%、 1.7%、 2.4%， 表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取 “2.6” 項(xiàng)下的同一供試品溶液， 分別于 0、 4、 8、 20、 24 h 時， 按 “2.1”項(xiàng)下的色譜條件檢測。結(jié)果6種化合物的峰面積的RSD 依 次 為 1.5%、 1.7%、1.9%、2.0%、2.1%、 2.2%， 表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取混勻的樣品 S5-3 粗粉 6 份，每份約 1.0 g， 精密稱定。 再分別取 “2.2” 項(xiàng)下單個對照品溶液母液適量， 分別稀釋 100 倍， 分別精密量取 10、5、 2、3、 5、 15 mL各 6 份， 加入 6份樣品中，加甲醇 60 mL， 分別按 “2.3”、 “2.1”項(xiàng)下的方法依法檢測， 計(jì)算， 結(jié)果見表2。

表 2 各成分的加樣回收率 （n=6）Tab.2 Determ ination results of recovery tests（ n=6）

2.9 樣品測定 取不同產(chǎn)地、 不同季節(jié)、 不同部位三叉苦樣品粗粉各約 2 g， 照 “2.3”、 “2.1”項(xiàng)下的方法，依法檢測，保留時間一致并紫外吸收光譜一致即認(rèn)定為同一化合物，計(jì)算。色譜圖見圖1， 結(jié)果見表 3。

3 分析

3.1 不同產(chǎn)地 芝麻素是云南西雙版納產(chǎn)三叉苦葉的特征性成分，在其他產(chǎn)地、其他部位中均未檢出該化合物；云南景谷和金平產(chǎn)三叉苦中吳茱萸春的量較高， 特別是葉， 高達(dá) 1.8% ～3.2%， 而其他產(chǎn)地的葉中均未檢出吳茱萸春。

總體上看， 吳茱萸春、 7-去甲基軟木花椒素和3-異戊烯基傘形花內(nèi)酯是 9 個產(chǎn)地三叉苦根和莖的共有成分。景谷的兩個樣品是不同月份采收的同一植株的不同的兩枝，如果作為一個樣品計(jì)的話，吳茱萸春在除 S11-3 外的所有 14 個根和莖樣品中均有檢出； 7-去甲基軟木花椒素和 3-異戊烯基傘形花內(nèi)酯都分別在12個樣品中檢出， 它們僅僅是異戊二烯基在香豆素母核上的位置不同，如果合并計(jì)的話，它們也在除 S8-3 外的所有 14 個樣品中均有檢出。

圖1 對照品和樣品 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

3.2 不同季節(jié) 如前所述， S6 和 S7 是標(biāo)準(zhǔn)的兩個不同季節(jié)樣品， S6-3 與 S7-3 中 7-去甲基軟木花椒素和 3-異戊烯基傘形花內(nèi)酯的含有量存在非常大的差異，但 S6-5 與 S7-5 則基本一致。 S4 與 S5，二者并不在同一地點(diǎn)采集，各成分含有量存在一定差異。

表 3 32 個三叉苦樣品中 6 種化合物測定結(jié)果 （ μg·g-1）Tab.3 Determ ination results of 32 sam p les（ μg·g-1）

3.3 不同部位 相對而言， 吳茱萸春是各部位的共有成分，在葉和/或根中的含有量高于莖，但在多個葉樣品中未檢出；7-去甲基軟木花椒素、3-異戊烯基傘形花內(nèi)酯、 3，7-二甲氧基山柰酚、 3，7，3'-三甲氧基槲皮素主要存在于莖和根中，均未在葉中檢出；芝麻素則未在根、莖中檢出。根的成分與莖基本一致而含有量稍高，莖皮的兩個黃酮類成分稍高，嫩枝的成分和含有量則介于葉和莖之間。

4 討論

本研究建立了 HPLC同時測定三叉苦中 6 種成分含有量的方法，操作簡便，重復(fù)性、回收率等較好， 結(jié)果準(zhǔn)確可靠。采用該方法對 9個產(chǎn)地的 11份采集樣共32個樣品進(jìn)行了測定。

4.1 關(guān)于樣品的產(chǎn)地和季節(jié) 西雙版納的 4 個產(chǎn)地是位于景洪西南約50 km內(nèi)的 4 個地點(diǎn)， 采集點(diǎn)海拔 670 ～1100 m。 景谷和金平采集點(diǎn)海拔1100 ～1200 m， 位于景洪北部和東部， 西雙版納采集點(diǎn)至景谷直線距離約 160 km，中間有瀾滄江相隔， 但無大型山脈相隔； 至金平約 260 km， 有瀾滄江和無量山余脈相隔。廣東鼎湖山與陽春直線距離約150 km。

從經(jīng)緯度分析， 云南 6 個產(chǎn)地分布在 N 21°～23°和 E 100°～103°間， 全部 9 個產(chǎn)地分布在 N 21°～23°和 E 100°～112°間， 根據(jù)文獻(xiàn)［6］， 臺灣、海南和西藏墨脫除外，中國三叉苦分布范圍在N 21°～25°和 E 99°～117°間。

本研究 11 份采集樣品的采收季節(jié)分布在 11 月份和3～7月份。

4.2 測定部位和測定成分的選擇 目前， 三叉苦商品藥材以莖和/或葉為主，嫩枝也是某些藥材標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的藥用部位，民間還有以根、樹皮藥用的記載［2，7-8］， 據(jù)此， 本實(shí)驗(yàn)把 三 叉 苦分解為 根、 樹皮、莖、嫩枝和葉等5個部位進(jìn)行比較測定，其中又以莖和葉為主。

三叉苦主要含有生物堿、色烯、香豆素和黃酮等多類具 有 鮮 明結(jié) 構(gòu) 特 點(diǎn)的 化 合 物［5，8-9］， 本 實(shí) 驗(yàn)選擇1個喹啉類生物堿，2個具異戊二烯結(jié)構(gòu)的香豆素，2個具有多甲氧基的黃酮苷元，以及1個木脂素，進(jìn)行定量比較研究，具有很好的代表性。6種成分都具有顯著的藥理活性［9-15］， 因此研究 結(jié)果同時具有較強(qiáng)的實(shí)際意義。

4.3 色譜條件的確定 比較了甲醇-水、 乙腈-水、乙腈 -0.1%磷酸、 乙腈 -0.1%三氟乙酸、 乙腈 -0.4%冰乙酸等作為流動相， 在不同梯度洗脫條件下的色譜效果，以方法項(xiàng)下的條件色譜效果最好，且能同時測定 6 種成分。6 種成分分別在 246.5（ 321 ）、 332 （ 220 ）、 324、 350 （ 267 ）、 355（253）、 286 （236） nm處有最大吸收峰， 根據(jù)各化合物在相應(yīng)波長下的吸收系數(shù)及其含有量高低，以及相應(yīng)波長下的基線情況和雜質(zhì)干擾情況，綜合研判，選擇方法項(xiàng)下的檢測波長。

4.4 供試品溶液的制備 分別以不同倍數(shù)的甲醇、乙醇、 60%乙醇作為溶劑， 以超聲、熱回流的方式進(jìn)行提取，結(jié)果以 50 倍量甲醇回流提取的提取率最高、基線最好、最省時省力。樣品中各成分的含有量差異較大，經(jīng)研究確定了最佳取樣量，但必要時還需根據(jù)測定結(jié)果，適當(dāng)稀釋后重復(fù)測定，以使各成分均在線性范圍內(nèi)。

4.5 測定結(jié)果綜合分析 如果不分部位而以全株計(jì)， 吳茱萸春分布于全部9 個產(chǎn)地的所有 11個三叉苦采集樣中， 7-去甲基軟木花椒素和 3-異戊烯基傘形花內(nèi)酯分布范圍次之， 3，7-二甲氧基山柰酚和3，7，3'-三甲氧基槲皮素再次之， 芝麻素僅分布于西雙版納產(chǎn)三叉苦中。

把9個產(chǎn)地分成3個區(qū)域，一為云南西雙版納州， 包括 S1 ～S5， 它們的根和莖中均含有除芝麻素以外的5種化合物，且根中的含有量均明顯高于莖，為傣醫(yī)應(yīng)用根提供了一定的依據(jù)，最顯著的特征是它們的葉中均含有化合物芝麻素，這很可能成為它們的鑒別指標(biāo)；二為云南景谷縣和金平縣，包括 S6 ～S8， 它們的各部位中均未檢出 3，7-二甲氧基山柰酚、3，7，3'-三甲氧基槲皮素和芝麻素，7-去甲基軟木花椒素和 3-異戊烯基傘形花內(nèi)酯也僅在部分樣品、部分部位中檢出，但不僅全部9個樣品中均檢出吳茱萸春，而且其含有量較高，特別是葉中的含有量高達(dá) 1.8% ～3.2%， 這同樣很可能成為它們的鑒別指標(biāo)；三為廣西 （梧州市）和廣東（鼎湖山及陽春市）， 包括 S9 ～S11，它們的葉中均未檢出 6 種化合物，S9-3 和 S10-3 均含有除芝麻素以外的 5 種化合物， S11-3 和-4 中只檢出 3-異戊烯基傘形花內(nèi)酯， S11-1 中檢出吳茱萸春和 3-異戊烯基傘形花內(nèi)酯。

總之，本研究結(jié)果表明，不同產(chǎn)地三叉苦的相同部位間，同一產(chǎn)地三叉苦的不同部位間，以及同一產(chǎn)地但不同季節(jié)三叉苦的同一部位間，6種化學(xué)成分各自的含有量均存在較大差異，但亦有一定的特點(diǎn)和規(guī)律。不同產(chǎn)地三叉苦間成分的巨大差異，與其原植物在形態(tài)上的地理變異并成為一個多型種［1］有著必然的聯(lián)系。

綜上，為闡明三叉苦藥用物質(zhì)基礎(chǔ)，有效控制相關(guān)成方制劑及其原料三叉苦藥材的質(zhì)量，有必要在更大的經(jīng)緯度范圍內(nèi)，更大的時間 （季節(jié)）范圍內(nèi)采集更多樣品，在同一居群、同一植株內(nèi)采集多個同一季節(jié)及不同季節(jié)的樣品，進(jìn)行更多樣品、更多成分的定量比較研究，可能還需借助 DNA鑒定等多種技術(shù)手段開展研究。同時，需加強(qiáng)樣品的鑒定工作，樣品應(yīng)鑒定至原變種和變種，并關(guān)注原植物性狀的差異，以利于結(jié)果的綜合分析。

［ 1］ 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志： 第43卷第 2 分冊［M］.北京： 科學(xué)出版社， 1997： 59-63.

［ 2］ 楊增明， 馬志偉， 袁玲玲.傣醫(yī)藥研究［M］.昆明： 云南科學(xué)技術(shù)出版社， 2012： 76-82.

［3］ 朱盛華，羅 屹，高幼衡，等.三椏苦莖、葉成分的比較研究［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)， 2012， 28（3）： 294 ～298.

［ 4 ］ Wei H L， Zhou SX， Jiang Y， et al.Chemical constituents from leaves of Evodia lepta［ J］ .China JChin Mater Med， 2013， 38（8）： 1193-1197.

［ 5 ］ Shaari K， Zareen S， Akhltar M N， etal.Chemical constituents of Melicope ptelefolia ［ J］ .Nat Prod Commun， 2011， 6 （3 ）：343-348.

［6］ 傅國立， 陳潭清，郎楷永， 等.中國高等植物： 第8卷［M］.青島： 青島出版社， 2001： 415.

［ 7 ］ Van N H， Kamperdick C， Sung TV， et al.Benzopyran dimers from Melicope ptelefolia ［ J］ .Phytochemistry， 1998， 48 （ 6 ）：1055-1057.

［ 8 ］ Li SG， Tian H Y， YeW C， etal.Benzopyrans and furoquinoline alkaloids from Melicope pteleifolia［J］ .Biochem Syst Ecol， 2011， 39（1）： 64-67.

［ 9］ 朱盛華.三椏苦的化學(xué)成分及莖葉成分的比較研究 ［D］.廣州： 廣州中醫(yī)藥大學(xué)， 2009.

［10］ 梁 粵.三叉苦抗炎鎮(zhèn)痛作用及脂溶性化學(xué)成分研究［D］.廣州： 廣東藥學(xué)院， 2010.

［11］ 張國鐸， 李 航.香豆素類化合物的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國藥業(yè)， 2011， 20（17）： 1-3.

［12］ Yoo H H， Lee M W， Kim Y C， et al.Mechanism-based inactivation of cytochrome P450 2A6 by decursinol angelate isolated from Angelica Gigas［ J］ .Drug Metab Dispos， 2007， 35（10 ）：1759-1765.

［13］ 郭瑞霞， 李力更， 霍長虹， 等.槲皮素甲基化衍生物的半合成及構(gòu)效關(guān)系［J］.中草藥， 2013， 44（3）： 359-369.

［14］ 張世卿， 張水成.芝麻素研究進(jìn)展［ J］.氨基酸和生物資源， 2005， 27（3）： 17-21.

［15］ 白金權(quán)， 車成日.芝麻素的提取及藥理作用研究現(xiàn)狀［ J］.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 35（3）： 229-232.

Distribution comparison of six constituents from Evodia lepta

YANG Shu-juan1， YU Ling1， KANG Guo-jiao1， ZHOU Hai-yu1， YANG Zeng-ming1，2*
（1.Liangfang Research and Development Center of Pattra Medicine of Yunnan， Kunming 650217， China； 2.Kunming Institute of Pattra Medicine，Kunming 650217， China）

AIM To compare six constituents in Evodia lepta from different habitats， different harverst time and different parts in south China.METHODS HPLCmethod for six constituents was established with amobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution in gradient elution manner.The detection wavelength were set up at246， 330， 285 nm.RESULTS The six constituents were well separated ， and showed a good linearity， r=0.999 7-0.999 8.The average recovery was in the ranges of 97.84%-100.61%， RSD 1.12%-3.89%.CONCLUSION The content of all the six constituents showed significant difference in the 32 samples of Evodia lepta from nine habitats.Among these six constituents， evolitrine is themostwidely distributed，relatively high in particular in the leaves from Jinggu and Jinping districts.，7-demethylsuberosin and 3-（3-methyl-but-2-enyl） umbelliferone in turn， kamatakenin and pachypodol the third.Sesamin is only detected in the leaves of Evodia lepta from Xishuangbanna.

Pattra medicine； Evodia lepta； sesamin； 7-demethylsuberosin；3-（3-methyl-but-2-enyl） umbelliferone； evolitrine

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）03-0580-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.029

2013-09-26

“十二五” 國家科技支撐計(jì)劃 （2012BAI27B06-1） ， 云南省科技計(jì)劃 （2013AE001）

楊樹娟 （1983—）， 女， 工程師， 研究方向： 中藥及民族藥。

*通信作者： 楊增明 （1965—） ， 男， 正高級工程師。 E-mail： bydyy@188.com