RP-HPLC法測(cè)定香椿葉中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷

顧芹英， 李慧華， 秦 冬，2， 郭 敏， 楊 歡*， 賈曉斌，2*

（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2.江蘇省中醫(yī)藥研究院， 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥口服制劑釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室， 江蘇 南京 210028）

RP-HPLC法測(cè)定香椿葉中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷

顧芹英1， 李慧華1， 秦 冬1，2， 郭 敏1， 楊 歡1*， 賈曉斌1，2*

（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2.江蘇省中醫(yī)藥研究院， 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥口服制劑釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室， 江蘇 南京 210028）

目的 建立測(cè)定中 藥 香 椿葉中槲 皮 素-3-O-α-L-鼠李糖 苷 的反相高 效 液相色譜 法。 方 法 采 用 Waters XBridge Shield RP18色譜 柱 （ 4.6 mm × 150 mm， 5 μm） ， 流 動(dòng) 相 為 乙 腈 -0.1% 甲 酸 水 溶 液 （20 ∶80） ， 體 積 流 量 為 1.0 m L/m in， 檢測(cè)波長(zhǎng)為 254 nm， 柱溫為 40 ℃。 結(jié)果 在以上色譜條件下， 供試品溶液中的槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷與干擾成分完全分離， 其在 5.260 ～105.2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 （r2=0.999 1）， 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) RSD=1.96% （n= 6）， 平均加樣回收率為 99.3% ～104.1% （n=3）， RSD為 4.23% ～4.78%。 結(jié)論 6 個(gè)產(chǎn)地香椿葉中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的量分別為 0.826% ±0.025% （山西運(yùn)城）、 0.271% ±0.006% （河南西平）、 0.459% ±0.016% （河南焦作）、 0.222% ±0.006% （四川簡(jiǎn)陽）、 0.808% ±0.019% （山東西牟） 和 0.293% ±0.008% （江蘇鎮(zhèn)江）。

香椿； 香椿葉； 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷； 反相高效液相色譜法

中藥香椿葉 Toonae sinensis Folium為楝科 Meliaceae喬 木 香 椿 Toona sinensis Roem 的 干 燥 樹葉［1-2］， 味苦、 性溫， 無 毒， 有清熱收斂、 消 炎 解毒、去燥濕等功效，臨床上常用于治療腸炎、痢疾等疾?。?］。 由于其突出的療效以及世界范圍內(nèi)對(duì)天然抗氧化劑的旺盛需求，近幾年里，對(duì)該中藥的抗氧化活性和相應(yīng)有效化學(xué)成分的研究較為深入［4-9］。 活性篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 從香椿葉中分 離得到的眾多多酚類化合物之中， 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷具有較 強(qiáng) 的 抗 氧 化 作 用［10-11］， 被 認(rèn) 為 是香 椿 葉中的重要活性物質(zhì)之一。

目前， LC-MS 已用于鑒別香椿葉中的沒食子酸及其衍生物等［2，12］。 然而， 對(duì)于槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷這一香椿葉中的重要活性物質(zhì)，其定量分析方法以及不同產(chǎn)地藥材中該化合物的量比較至今尚未見任何報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了香椿葉中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的反相高效液相色譜分析方法，并測(cè)定了6個(gè)產(chǎn)地香椿葉中該化合物，從而為香椿葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與材料

Waters XBridgeShield RP18色譜柱 （4.6 mm × 150 mm， 5 μm）； Mettler-Toledo AE240 電子分析天平 （0.01 mg）； 乙腈 （色譜純， Honeywell）， 甲酸（分析純， 國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司）， 甲醇 （分析純， 成都科龍化工試劑廠）， 雙蒸水為實(shí)驗(yàn)室自制； 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷為本實(shí)驗(yàn)室分離得到， 并經(jīng)1H-NMR和13C-NMR鑒定。

香椿葉分別采收自河南西平 （2012 年 7 月）、河南焦作 （2012 年 8 月）、 山西運(yùn)城 （2011 年 8月）、 四川簡(jiǎn)陽 （2012 年 6 月）、 山東西牟 （2011年7 月）和江蘇鎮(zhèn)江 （2013 年 7 月）， 并經(jīng)江蘇大學(xué)生藥學(xué)研究所陳鈞教授鑒定為 T.sinensis的葉。鮮葉置通風(fēng)處陰干， 粉碎后過 40 目篩， 收集細(xì)粉供分析用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters XBridge Shield RP18色譜柱（150 mm ×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相為乙腈 -0.1%甲酸水溶液 （20 ∶80）； 體積流量 1.0 mL/min； 檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm； 柱溫 40 ℃； 進(jìn)樣量 20 μL。

2.2 對(duì)照品貯備液的制備 精密稱取槲皮素貯備液-3-O-α-L-鼠李糖苷對(duì)照品 10.52 mg， 加 60%甲醇溶解并定容至 50 m L， 配制成質(zhì)量濃度為 210.4 μg/mL的對(duì)照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備 取香椿葉細(xì)粉 0.100 g，精密稱定， 置 50 m L具塞離心管中， 精密加入60%甲醇 25 m L， 稱重， 超聲提取 15 min， 冷卻至室溫， 加 60%甲醇補(bǔ)足失質(zhì)量， 取上清液， 0.20 μm微孔濾膜濾過， 棄去初濾液5 mL， 取續(xù)濾液作為供試品溶液，待測(cè)。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取 “2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品貯備液 5、4、 3、 2、 1 mL， 移入 10 mL量瓶中， 加入 60%甲醇稀釋至刻度， 搖勻，得質(zhì)量濃 度 為 105.2、 84.16、 63.12、 42.08、 21.04 μg/mL對(duì)照品溶液； 再將 21.04 μg/m L對(duì)照品溶液進(jìn)行兩次二倍稀釋， 分別得到質(zhì)量濃度為 10.52 μg/mL和 5.260 μg/mL的對(duì)照品溶液； 以上 7 份溶液按照 “2.1” 項(xiàng)色譜分析條件進(jìn)樣測(cè)定。 以峰面積 （Y） 為縱坐標(biāo)， 質(zhì)量濃度 （X， μg/mL） 為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得回歸方程為 Y= 42 087.120 7X-4 170.292 5， r2=0.999 1。

2.5 精密度考察 分別吸取低、 中、 高 3 個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液和供試品溶液 （江蘇鎮(zhèn)江樣品）， 按照 “2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)進(jìn)樣 6 次，計(jì)算得槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖 苷 的 峰 面 積 RSD 分 別 為 1.41%、 1.95%、1.87%和 0.90%， 表明儀器的進(jìn)樣精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 吸取同一份供試品溶液 （江蘇鎮(zhèn)江樣品，室溫下保存）， 分別于 0、 2、 4、 6、 8、 12、 24、 36、 48 h， 按照 “2.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算得該化合物峰面積的 RSD為 1.53%， 表明在48 h內(nèi)供試品溶液的性質(zhì)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按照 “2.3” 項(xiàng)下方法制得供試品溶液 6 份 （江蘇鎮(zhèn)江樣品）， 按照 “2.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算該化合物在藥材中含有量的RSD為 1.96%， 表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定含有量的藥材粉末 9 份 （江蘇鎮(zhèn)江樣品）， 每份 50.0 mg， 精密稱定，精密加入一定量的對(duì)照品溶液 （高、中、低3種加入量， 各重復(fù) 3 次）， 用 60% 甲醇補(bǔ)足至25 mL， 其余按照 “2.3” 項(xiàng)下方法制得供試溶液共 9 份， 并按照 “2.1” 項(xiàng)下測(cè)定， 計(jì)算加樣回收率， 和 RSD， 結(jié)果如表1 所示。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.9 樣品測(cè)定 按照 “2.3” 項(xiàng)下方法制得 6 批藥材供試品溶液各 3 份， 按照 “2.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積，代入回歸方程，并計(jì)算所測(cè)成分在藥材中的百分含有量。 結(jié)果顯示， 香椿葉中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的含有量分別為 0.826% ±0.025% （山西運(yùn)城）、0.271% ±0.006% （河南西平）、 0.459% ±0.016%（河 南 焦 作）、 0.222% ±0.006% （ 四 川 簡(jiǎn) 陽）、0.808% ±0.019% （山東西牟） 和 0.293% ±0.008%（江蘇鎮(zhèn)江）。 色譜圖見圖1、 圖2。

圖1 對(duì)照品溶液的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the reference solution

圖2 6個(gè)產(chǎn)地香椿葉的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of samples from six habitats

3 結(jié)論與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)中比較了 4 根色譜柱， 即 Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8（ 4.6 mm × 150 mm， 5 μm） 、Thermo ODSHypersil（4.6mm ×150mm， 5 μm） 、Merck Chromolith Performance RP-18e（4.6 mm × 100 mm， 5 μm） 、 Waters XBridge Shield RP18（4.6 mm × 150 mm， 5 μm） ， 最 終 發(fā) 現(xiàn) 使 用 Waters XBridgeShield RP18（4.6 mm × 150 mm， 5 μm）時(shí)，出峰時(shí)間適中，峰對(duì)稱性好，并且可與其他峰達(dá)到基線分離，最終為本實(shí)驗(yàn)采用。

3.2 實(shí)驗(yàn)中比較了不同體積分?jǐn)?shù)甲醇 （20%、40%、 60%、 80%和 100%） 為溶劑以及不同超聲時(shí)長(zhǎng) （15 min、 30 min、 45 min 和 60 min） 的 提 取效果， 發(fā)現(xiàn)以 60%甲 醇 超 聲 提 取 香 椿 葉粉末 15 min， 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的色譜峰面積最大。3.3 對(duì)從不同產(chǎn)地采收得到的香椿葉樣品進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果表明，山東西牟、山西運(yùn)城和河南焦作產(chǎn)香椿葉中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的量明顯高于江蘇鎮(zhèn)江、河南西平、四川簡(jiǎn)陽三個(gè)產(chǎn)地，而山東、山西和河南是香 椿 的 道 地 產(chǎn) 區(qū)［13］， 可 見 該 化 合 物的量與香椿藥材的道地性呈現(xiàn)正相關(guān)。

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Determ ination of quercetin-3-O-α-L-rhamnoside in Toonae sinensis Folium by RP-HPLC

GU Qin-ying1， LIHui-hua1， QIN Dong1，2， GUO Min1， YANG Huan1*， JIA Xiao-bin1，2*

（1.School of Pharmacy， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China； 2.Key Lab of ChineseMedicine Delivery System of SATCM， Jiangsu Provincial Academy of ChineseMedicine， Nanjing 210028， China）

Toona sinensis； Toonae sinensis Folium； quercetin-3-O-α-L-rhamnoside； RP-HPLC

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）03-0577-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.028

2013-08-06

江蘇省自然科學(xué)基金 （BK2012290）； 常州市科技支撐計(jì)劃 （CE20125042）； 江蘇大學(xué)高級(jí)人才科研啟動(dòng)基金 （11JDG073）；江蘇大學(xué)學(xué)生科研立項(xiàng)項(xiàng)目 （12A491）

顧芹英 （1990—）， 女， 碩士生， 研究方向： 中藥學(xué)。

*通信作者：楊 歡，男，副教授。賈曉斌， 男， 教授， 研究方向： 中藥物質(zhì)基礎(chǔ)。 Tel：（025）85608672， E-mail： jxiaobin2005@hotmail.com