金錢白花蛇商品藥材的高效毛細管電泳指紋圖譜研究

許 靖， 王成芳， 杜樹山， 孟繁蘊， 李 峰*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧 大連 116600； 2.北京師范大學(xué)中藥資源保護與利用北京市重點實驗室， 北京 100875）

金錢白花蛇商品藥材的高效毛細管電泳指紋圖譜研究

許 靖1， 王成芳2， 杜樹山2， 孟繁蘊2， 李 峰1*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧 大連 116600； 2.北京師范大學(xué)中藥資源保護與利用北京市重點實驗室， 北京 100875）

目的 建立 10 批金錢白花蛇藥材的毛細管電泳指紋圖譜。 方法 超純水超聲提取， 以 50 mmol/L硼砂 -200 mmol/L硼酸 （pH8.64） 作為背景電解質(zhì)緩沖液， 分析在 Beckman P/ACE System MDQ高效毛細管電泳儀上進行， 柱溫 25 ℃， 分離電壓 20 kV， 檢測波長 245 nm， 20 min 完全分離。 結(jié)果 建立的指紋圖譜有 9 個共有峰， 且方法學(xué)考察達到標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)論 金錢白花蛇 HPCE指紋圖譜與蘄蛇和烏梢蛇有明顯差別。

金錢白花蛇；毛細管電泳；指紋圖譜

金錢白花蛇 Bungarus Parvus為眼鏡蛇科動物銀環(huán)蛇 Bungarus multicinctus Blyth 的 幼 蛇 干 燥 體。具有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙的功效，臨床上常用于治療風(fēng)濕頑痹、麻木拘攣、中風(fēng)口眼斜、半身不遂、抽搐痙攣、 破傷風(fēng)、 麻 風(fēng)、疥廯［1］。 本課 題組已經(jīng)對金錢白花蛇核苷、蛋白質(zhì)、多胺等類成分的分析，也有報道利用分子生物學(xué)技術(shù)，對金錢白花蛇進行鑒別［2-4］， 但關(guān)于毛 細管電泳指紋圖譜 的研究未見報道。 本實驗采用高效毛細管電泳法對 11批金錢白花蛇商品藥材進行了指紋圖譜研究及方法學(xué)考察，以期對金錢白花蛇商品藥材的品種鑒定提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Beckman P/ACE System MDQ高效毛細管電泳儀 （美國貝克曼庫爾特公司）； DAD檢測器；32Karat色譜工作 站。 未涂層石英 毛 細 管柱 （50 μm×65 cm， 鄭州應(yīng)諾高科有限公司）； AG204 電子分析天平 （METTLER TOLEDO公司）； KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；LG16 型高速離心機 （北京雷勃爾公司）； SevenmultipH計 （METTLER TOLEDO公司）。

1.2 試劑 尿苷 （中國藥品生物制品檢定所， 批號 887-200001）； 所用試劑均為市售分析純，水為超純水； 所用試劑均通過 0.22 μm微孔濾膜濾過。

1.3 實驗材料 金錢白花蛇商品藥材為購于不同地區(qū)的商品藥材， 經(jīng)李峰教授鑒定， 詳見表1。

表1 金錢白花蛇藥材商品來源及采購地區(qū)Tab.1 Sam p les of Bungarus Parvus

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備［5］取尿苷對照品適量，精密稱定， 加水制成每 1 mL含 0.05 mg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備［6］取 50 ℃恒溫干燥的各金錢白花蛇樣品粉末 （ 過 100 目篩） 約 0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入超純水10 mL， 密塞，超聲處理 30 min，離心 10 min （3000 r/min）， 取上清液過 0.22 μm微孔濾膜， 取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 電泳條件 毛細管柱 （55 cm×50 μm）， 分離電壓 20 kV， 柱溫 25 ℃，背 景電解 質(zhì)為 50 mmol/L硼砂 -0.2 mol/L硼酸 （pH8.6）， 檢測波長 245 nm， 以 30 mbar×5s壓力進樣。 新毛細管柱以 1 mol/LNaOH沖洗 30 min 活化，每次進樣前，分別 用 1 mol/L NaOH、水、緩 沖 液 運 行 沖 洗5 min［7］。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 將 9#供試品溶液連續(xù)進樣 5次，測得指紋圖譜，各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積 RSD分別小于 0.65%和 4.96%， 表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 新制備的 9#供試品溶液放置0、 2、4、 8、 12 h 時進樣分析， 結(jié)果樣品在 12 h內(nèi)共有電泳峰的相對保留時間 RSD≤0.53%， 相對峰面積的 RSD≤4.89%， 表明供試品在測定的 12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取 9#金錢白花蛇樣品 5 份，按 “2.2” 項方法平行制備供試液， 按 “2.3” 項電泳條件進行進樣分析，記錄電泳圖，計算其共有指紋峰的相對保留時間 RSD均≤0.63%， 共有指紋峰相對峰面積的 RSD均≤4.83%， 說明此方法測定的重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 參照物峰的選擇 取尿苷對照品溶液及 8#樣品供試品溶液，按上述電泳條件進樣測定，對照品及 8#樣品的 HPCE譜圖見圖 1、 2， 其峰位及峰面積分別見表 2、 3。 對比遷移時間確定 S 峰為尿苷，在供試液中加入對照品溶液，進樣分析，電泳峰增益結(jié)果進一步證實了結(jié)論正確，故選定S為參照物峰［8］， 以此標(biāo)定各樣品共有峰的相對保留時間及相對峰面積。

圖1 尿苷 HPCE圖Fig.1 HPCE fingerprint of uridine

2.5.2 指紋圖譜的建立 取 “2.2” 項下方法制備的各供試品溶液，按篩選好的電泳條件進行測試， 測得各供試品的 HPCE譜圖。 除 11#樣品的HPCE色譜圖外 （見圖 3）， 各樣品的 HPCE色譜指紋圖譜具有相似性。 將 1#～10#測試結(jié)果導(dǎo)入國家藥典委員會 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版”軟件，選擇多點校正，色譜峰自動匹配，同時生成對照圖譜 R（ 圖 4），選取 9 個共有峰，作為構(gòu)建的指紋圖譜特征峰，得到金錢白花蛇藥材HPCE色譜指紋圖譜共有模式 （圖 5）。 金錢白花蛇供試樣品的相對保留時間和相對峰面積構(gòu)成了其指紋特征［9］， 結(jié)果見表 2、 3。

圖 2 8#樣品 HPCE圖Fig.2 HPCE fingerprints of 8#

圖 3 11#樣品的 HPCE圖Fig.3 HPCE fingerp rints of 11#

圖4 金錢白花蛇藥材 HPCE對照指紋圖譜 RFig.4 HPCE reference fingerprints of Bungarus Parvus

圖5 金錢白花蛇藥材 HPCE指紋圖譜共有模式Fig.5 M utualmode HPCE fingerprints of Bungarus Parvus

2.6 指紋圖譜的分析與評價 將測得的 1#～10#樣品指紋圖譜結(jié)果及生成的對照圖譜導(dǎo)入 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)B版”軟件，以對照圖譜 R為基準(zhǔn)， 1#～10#金錢白花蛇藥材商品的相似度結(jié)果見表4。

3 小結(jié)與討論

3.1 由表 4 結(jié)果可見， 1#～10#金錢白花蛇藥材商品的 HPCE圖譜相對于對照圖譜 R的相似度， 除1#樣品 （0.635）外均大于 0.9。 按照 《 中藥材指紋圖譜的技術(shù)要求》， 大于 0.9 的樣品即認(rèn)為是同一品 種［10］， 故 2#～10#金 錢 白 花 蛇 藥 材 樣 品 品種一致。

3.2 關(guān)于相似度小于 0.9 的 1#樣品， 該批藥材除個體較大不符合 《中國藥典》 的規(guī)定外，品種上與其他樣品并無差異；其指紋圖譜共有峰的相對保留時間也與其他樣品并無異，僅8號峰的相對峰面積明顯高于其他樣品。由圖譜上也可看出峰面積較其他樣品大，表明金錢白花蛇商品藥材其水溶性成分含有量存在差異。故采用高效毛細管電泳法，不僅可以對金錢白花蛇商品藥材進行品種鑒別，同時也可以作為其質(zhì)量控制的方法。

表2 金錢白花蛇 HPCE指紋圖譜共有峰的相對保留時間Tab.2 Relative retention time of common peaks of HPCE fingerprints of Bungarus Parvus

表3 金錢白花蛇 HPCE指紋圖譜共有峰的相對峰面積Tab.3 Relative peak areas of common peaks of HPCE fingerprints of Bungarus Parvus

表4 金錢白花蛇商品藥材 HPCE指紋圖譜與共有模式的相似度Tab.4 Sim ilarity judgment validation of HPCE fingerprints from different sam p les

3.3 由圖 3 可見， 金錢白花蛇成蛇 （11#號樣品）的 HPCE色譜圖中， 3 號峰明顯高于其他峰， 而 4、5、 S號峰無響應(yīng)值， 表明金錢白花蛇其成蛇和幼蛇的水溶性成分差異明顯。故采用高效毛細管電泳法，不僅可以對金錢白花蛇藥材商品進行品種鑒別，同時對不同生長期的金錢白花蛇進行鑒別。

3.4 本課題組已建立了蘄蛇、 烏梢蛇商品藥材的HPCE指紋圖譜［7，11］。 比較金錢白花蛇與蘄蛇、 烏梢蛇商品藥材的 HPCE指紋圖譜 （僅緩沖溶液的摩爾濃度稍有差異，這僅影響電泳圖譜的分離度，而對峰的數(shù)量影響較?。?，三種不同來源的蛇類其指紋峰有明顯的差異，說明毛細管電泳指紋圖譜對其品種的鑒別是有一定意義的。

3.5 參照物峰的選擇， 已報道金錢白花蛇藥材含有尿苷［2］， 且尿苷是構(gòu)成動物細胞核酸的主要成分， 并具有 多 種 生 物 活 性［12-13］。 因 此， 本 實 驗 選擇尿苷作為金錢白花蛇 HPCE指紋圖譜的參照物。

3.6 電泳條件的選擇

3.6.1 本實驗比較了硼酸鹽和磷酸鹽兩種緩沖體系對電泳 的 影 響［14-15］， 結(jié) 果 硼 酸鹽 緩 沖 體系 的 電泳圖譜基線平穩(wěn)，重復(fù)性較好；同時，又分別比較了濃度為 20、30、 50、 70 mmol/L的硼砂緩沖溶液的電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)奶岣呔彌_溶液的濃度有利于分離，但因濃度過高產(chǎn)生的焦耳熱多，影響其分離效率， 故選用濃度 50 mmol/L緩沖溶液為宜。

3.6.2 本實驗還分別考察了電壓在 15 ～25 kV時，對分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著分離電壓的增加，雖遷移時間相應(yīng)縮短，但由于電流增加，焦耳熱增多， 基線噪音變大［16］。 故綜合考慮選擇電壓為20 kV。

［ 1 ］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典： 2010 年版一部［S］.北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010： 204.

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HPCE fingerprint of Bungarus Parvus

XU Jing1， WANG Cheng-fang2， DU Shu-shan2， MENG Fan-yun2， LIFeng1*
（1.College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional ChineseMedicine， Dalian 116600， China； 2.Protection and Utilization of Traditional Chinese Medicine of Beijing Area Major Laboratory， Beijing Normal University， Beijing 100875， China）

AIM To establish a high-performance capillary electrophoresis（HPCE） method for fingerprint of Bungarus Parvus collected from ten differentsources.METHODS 50mmol/L borax-200mmol/L boricacid buffer solution （ pH8.64） was used for electrolyte buffer and the analysiswas performed on Beckman P/ACE System MDQ at column temperature of 25 ℃， isolating voltage 20 kV， and the detection wavelength of 245 nm.RESULTS Nine fingerprint peakswere obtained， and the validation of themethodmet the requirements for SFDA’S technical regulations.CONCLUSION The high-performance capillary electrophoresis fingerprint shows that the electrophoretogram of Bungarus Parvus has a distinct diffence from that of Agkistrodon and Wushaoshe.

Bungarus Parvus； HPCE； fingerprint

R284.1

A

1001-1528（2014）03-0563-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.025

2013-05-10

國家自然基金資助項目 （30973881）； 高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目 （博導(dǎo)類） （20122133110002）

許靖 （1988—）， 女 （ 滿 族） ， 碩 士 生， 研 究 方 向： 中 藥 材 品 質(zhì) 評 價。 Tel： （ 0411 ） 87586318， E-mail： xujing020513@ 163.com

*通信作者： 李 峰， 博士生導(dǎo)師。 Tel：（0411）87586318， E-mail： zhanglijiayi@163.com