HPLC-UV-ELSD法測(cè)定益肝樂顆粒中槲皮素、 山柰素、 柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷d

譚雄斯

（肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 廣東 肇慶 526020）

［質(zhì) 量］

HPLC-UV-ELSD法測(cè)定益肝樂顆粒中槲皮素、 山柰素、 柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷d

譚雄斯

（肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 廣東 肇慶 526020）

目的 采用 HPLC-UV-ELSD法測(cè)定益肝樂顆粒 （垂盆草、 柴胡、 板藍(lán)根等） 中槲皮素、 山柰素、 柴胡皂苷 a和柴胡皂苷 d 的量。 方法 Hypersil C18色譜柱 （4.6mm×150mm， 5 μm） ； 體積流量 0.8mL/min； 槲皮素和山柰素的檢測(cè)流動(dòng)相為甲醇-水-三氟乙酸 （40 ∶60 ∶0.05）， 檢測(cè)波長(zhǎng) 360 nm。 柴胡皂苷 a和柴胡皂苷 d 的檢測(cè)流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水 （25 ∶45 ∶30）， ELSD漂移管溫度 95 ℃， 載氣 （N2） 體積流量 2.4 SLPM/m in。 結(jié)果 槲皮素和山柰素分別在0.071 3 ～1.426 μg（r=0.999 7）、 0.056 8 ～1.136 μg（r=0.999 3） 進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系， 平均加樣回收率分別為 97.73%、 96.97%， RSD （n=6） 分別為 1.63%、 1.52%。 柴胡皂苷 a和柴胡皂苷 d 分別在 0.041 6 ～0.832 0μg（r=0.999 2）、 0.026 7 ～0.534 0 μg（r=0.999 5） 進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)值與峰面積的自然對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系， 平均加樣回收率分別為 97.35%、 98.04%， RSD（n=6） 分別為 0.81%、 1.16%。 結(jié)論 該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好。

益肝樂顆粒； 槲皮素； 山柰素； 柴胡皂苷a； 柴胡皂苷d

益肝樂顆粒為中藥復(fù)方制劑，源于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第四冊(cè)，由垂盆草、柴胡、云芝提取物、郁金、板藍(lán)根、五味子等六味藥物組成。具有清熱利濕，舒肝解郁，扶正固本之功效，可用于濕熱蘊(yùn)蒸，身目俱黃，或兩脅痹滿疼痛，體倦懶食，溲赤便溏，舌苔黃膩等，西醫(yī)診斷為急性黃疸型和非黃疸型肝炎，慢性遷延型肝炎等癥的治療［1-2］。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì) 該品種進(jìn)行了顯微 鑒別控制，未對(duì)方中的任何藥味進(jìn)行定性鑒別或定量測(cè)定。為保證產(chǎn)品質(zhì)量，確保臨床療效，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)垂盆草中槲皮素、山柰素和柴胡中柴胡皂苷 a、 柴胡皂苷 d 進(jìn)行定量測(cè)定方法研究，為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，能有效控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，確保人民用藥安全有效。

1 材料

高效液相色譜儀 （日本島津 LC-10ATVP型，島津自動(dòng)進(jìn)樣器 SIL-10ADVP）； ANASTAR色譜數(shù)據(jù)工作站； 紫外可見檢測(cè)器 （型號(hào) SPD-1OAVP）；Alltech 2000ES 型 蒸 發(fā)光 散 射 器； 槲 皮 素 對(duì) 照 品（批號(hào)為 100081-200406）、 山柰素對(duì)照品 （批號(hào)為110861-200405）、 柴 胡 皂 苷 a對(duì) 照 品 （ 批 號(hào) 為110777-200405） 和柴 胡皂苷 d 對(duì) 照品 （ 批號(hào)為110778-200404） 均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；益肝樂顆粒 （10 g/袋；批號(hào)為 130412， 130420，130424） 購(gòu)于吉林益民堂制藥有限公司； 甲醇、乙腈 （色譜純， 安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司）， 三氟乙酸 （色譜純，科密歐化學(xué)國(guó)際有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 槲皮素和山柰素的測(cè)定［3-12］

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 Hypersil C18色譜柱 （4.6 mm×150 mm， 5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水-三氟乙酸 （40 ∶60 ∶0.05）； 體積流量為 0.8 m L/min， 檢測(cè)波長(zhǎng) 360 nm。 在此條件下槲皮素和山柰素與其他組分基線分離良好，以槲皮素計(jì)理論塔板數(shù)應(yīng)不低于 3 000。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別取槲皮素和山柰素對(duì)照品適量， 加流動(dòng)相溶解制成每 1 mL含 0.05 mg的溶液， 按紫外-可見分光光度法在 300 ～500 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外掃描， 結(jié)果槲皮素和山柰素對(duì)照品均在 360 nm處有最大吸收， 參照 《中國(guó)藥典》 2010 年版一部垂盆草藥材檢驗(yàn)項(xiàng)下的檢測(cè)波長(zhǎng) 360 nm， 故檢測(cè)波長(zhǎng)定為 360 nm。

2.1.3 對(duì)照品混合溶液的制備 精密稱取槲皮素和山柰素對(duì)照品適量， 置 100 m L量瓶中， 加甲醇-25%鹽酸溶液 （4 ∶1） 混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品混合溶液 （槲皮素為0.071 3 mg/mL和山柰素 0.056 8 mg/mL）。

2.1.4 供試品溶液的制備 取本品適量， 研細(xì)，取約 5.0 g， 精密稱定， 精密加入甲醇-25%鹽酸溶液 （4 ∶1）混合溶液 50 mL， 稱定質(zhì)量，超聲 （功率 250W， 頻率 35 kHz）處理 20min，放冷， 再稱定質(zhì)量， 用甲醇-25%鹽酸溶液 （4 ∶1） 混合溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.5 陰性對(duì)照溶液的制備 按益肝樂顆粒處方比例稱取適量除垂盆草的其余藥味，按益肝樂顆粒的前處理和制劑生產(chǎn)工藝制成缺垂盆草的陰性樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成缺垂盆草的陰性對(duì)照溶液。

2.1.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品混合溶液 1、 5、 10、 15、 20 μL， 按 “2.1.1” 項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，槲皮素、山柰素量為橫坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，槲皮素回歸方程為 Y=3.763 1 ×106X-1 288.1， r= 0.999 7； 山柰素為 Y=4.010 8 ×106X+567.9， r= 0.999 3。結(jié)果表明槲皮素在 0.071 3 ～1.426 μg進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好；山柰素在 0.056 8 ～1.136 μg進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.7 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取 10 μL的供試品溶液、對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照溶液，按“2.1.1” 項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行色譜分析，結(jié)果供試品溶液色譜中，在與槲皮素和山柰素對(duì)照品相同保留時(shí)間處有吸收峰，而陰性對(duì)照溶液在相同保留時(shí)間處未顯吸收峰， 見圖1。

2.1.8 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液 （批號(hào)130412）， 在放置0、 1、 2、 4、 6、 8 h 后精密吸取10 μL進(jìn)樣， 測(cè)定其峰面積值， 槲皮素 RSD為0.59%， 山柰素 RSD為 0.76%。結(jié)果表明， 供試品溶液8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.9 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品混合溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次， 按 “2.1.1” 項(xiàng)的色譜條件測(cè)定槲皮素和山柰素的峰面積，結(jié)果表明，儀器精密度良好，槲皮素 RSD為 0.94%，山柰素 RSD為 0.81%。

2.1.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一個(gè)批號(hào)樣品 （批號(hào)130412）， 按上述方法制備 6 份供試品溶液， 分別測(cè)定，結(jié)果槲皮素和山柰素 RSD分別為 0.53%、0.72%。 結(jié)果表明本方法具有良好的重復(fù)性。

圖1 槲皮素和山柰素的 HPLC圖Fig.1 HPLC chromatgrams of quercetin and kaempferol

2.1.11 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量 （槲皮素0.69 mg/g、 山柰素0.57 mg/g） 的的同一批樣品（批號(hào) 130412） 適量， 研細(xì)， 取約 2.5 g， 精密稱定， 分別精密加入對(duì)照品混合溶液 25 mL、甲醇-25%鹽酸溶液 （4 ∶1） 混合溶液 25 mL， 按照“2.1.4” 項(xiàng)制備加樣供試液。 精密吸取加樣供試液 10 μL， 按上述測(cè)定方法測(cè)定其峰面積， 計(jì)算回收率， 結(jié)果表明本方法回收率良好， 見表1。

2.2 柴胡皂苷 a和柴胡皂苷 d 的測(cè)定［13-23］

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 Hypersil C18色譜柱 （ 4.6 mm ×150 mm， 5 μm）； 甲 醇-乙 腈-水（25 ∶45 ∶30） 為流動(dòng)相， 柱溫為室溫； 體積流量0.8 mL/min； 進(jìn) 樣量 10μL。 ELSD檢 測(cè)器檢測(cè)參數(shù)： 漂移管溫度 95 ℃， 載氣 （N2） 體積流量 2.4 SLPM/min。 理論塔板數(shù)以柴胡皂苷 a計(jì)算應(yīng)不低于 4 000。

2.2.2 對(duì)照品混合溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a對(duì)照品和柴胡皂苷d對(duì)照品各適量， 加甲醇制成對(duì) 照 品 混 合 溶 液 （ 柴 胡 皂 苷 a為 0.041 6 mg/mL， 柴胡皂苷 d 為 0.026 7 mg/m L）。

表1 槲皮素和山柰素回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests for quercetin and kaempferol

2.2.3 供試品溶液的配制 取本品適量， 研細(xì)，取約5.0 g， 精密稱定， 置具塞錐形瓶中， 加甲醇50 mL， 超聲處理 （250 W， 30 kHz） 20 min， 用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL， 置水浴上蒸干， 殘?jiān)铀?15 mL溶解， 溶液加于 AB-8 大孔樹脂柱 （120 mm×10 mm） 上，分別以100 mL的氨試液、水、 50%乙醇洗脫， 棄去洗脫液，再用乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至干， 殘?jiān)眉状既芙猓?移至10 mL量瓶中， 稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的配制 按益肝樂顆粒處方比例稱取適量除柴胡的其余藥味，按益肝樂顆粒的前處理和制劑生產(chǎn)工藝制成缺柴胡的陰性樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成缺柴胡的陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品混合溶液1、 5、 10、 15、 20 μL， 按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積的自然對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，柴胡皂苷a、 柴胡皂苷d量的自然對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得回歸方程。柴胡皂苷 a為 Y=1.364 2X+ 7.614 7，r=0.999 2；柴胡皂苷 d 為 Y=1.069 1X+ 5.095 4， r=0.999 5。 結(jié) 果 表 明 柴 胡 皂 苷 a在0.041 6 ～0.832 0 μg進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)值與峰面積的自然對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系；柴胡皂苷d在0.026 7 ～0.534 0 μg進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)值與峰面積的自然對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 陰性對(duì)照試驗(yàn) 分別精密吸取10 μL的供試品溶液、對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照溶液，按“2.2.1” 項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行色譜分析，結(jié)果供試品溶液色譜中，在與柴胡皂苷a對(duì)照品和柴胡皂苷d對(duì)照品相同保留時(shí)間處有吸收峰，而陰性對(duì)照溶液在相同保留時(shí)間處未顯吸收峰，見圖2。

圖2 柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷 d的 ELSD圖Fig.2 ELSD chromatogram s of saikosaponin a and saikosaponin d

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品混合溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次， 按 “2.2.1” 項(xiàng)的色譜條件測(cè)定柴胡皂苷 a和柴胡皂苷d的峰面積，測(cè)試結(jié)果表明儀器精密度良 好， 柴 胡 皂 苷 a 和 d 的 RSD 分 別 為0.61%、 0.85%。

2.2.8 重 復(fù) 性 試 驗(yàn) 取 同 一 批 樣 品 （ 批 號(hào)130412），按上述方法制備 6 份供試品溶液， 分別測(cè)定， 柴胡皂苷 a和柴胡皂苷 d 的 RSD分別為0.91%、 0.76%。 結(jié)果表明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.9 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液 （批號(hào)130412），在放置0、 1、 2、 4、6、 8 h 后， 測(cè)定其峰面積值，柴胡皂苷 a的 RSD為 0.57%，柴胡皂苷 d 的 RSD為 0.68%， 供試品溶液 8 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的同一批樣品 （批號(hào) 130412， 柴胡皂苷 a為 0.17 mg/g、柴胡皂苷 d 為 0.11 mg/g） 適量， 研細(xì)， 取約 2.5 g，精密稱定， 置錐形瓶中， 分別精密加入甲醇 40 mL， 加對(duì)照品混合溶液 10 mL，按 “2.2.3” 項(xiàng)下供試品溶液配制方法制成加樣供試液，按上述測(cè)定方法測(cè)定其峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果表明本方法回收率良好，見表2。

表2 柴胡皂苷 a和 d加樣回收率結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests for saikosaponin a and saikosaponin d

2.3 樣品測(cè)定 取 3 批樣品按 “2.1” 項(xiàng)下槲皮素和山柰素測(cè)定方法，分別精密吸取對(duì)照品混合溶液和供試品溶液各10 μL， 注入液相色譜儀， 測(cè)定槲皮素和山柰素的量， 結(jié)果見表3。

取3 批樣品按 “2.2” 項(xiàng)下柴胡皂苷 a和柴胡皂苷d測(cè)定方法，分別精密吸取對(duì)照品混合溶液5 μL、 10 μL和供試品溶液 10 μL， 注入液相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程分別測(cè)定本品中柴胡皂苷 a和柴胡皂苷d的量， 結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 （， n=3）Tab.3 Results of content determ ination（，n=3）

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 （， n=3）Tab.3 Results of content determ ination（，n=3）

批 號(hào) 槲皮素 /（ mg·g-1） 山 柰素 /（ mg·g-1） 柴 胡皂 苷 a/（ mg·g-1） 柴胡皂 苷 d/（ mg·g-1）130412 0.69 ±0.006 7 0.57 ±0.004 2 0.17 ±0.001 5 0.11 ±0.000 6 130420 0.71 ±0.004 0 0.58 ±0.003 5 0.17 ±0.001 5 0.11 ±0.001 0 130424 0.73 ±0.003 8 0.59 ±0.004 6 0.18 ±0.001 5 0.12 ±0.001 0

3 討論

3.1 垂盆草為方中主要藥物之一， 具有利濕退黃，清熱解毒之功效，可用于濕熱黃疸，小便不利，癰腫瘡瘍等癥狀的治療；《中國(guó)藥典》 2010 年版僅對(duì)垂盆草中的槲皮素、山柰素和異鼠李素的總量進(jìn)行了控制，未分別對(duì)各成分進(jìn)行定量分析，本實(shí)驗(yàn)中曾對(duì)益肝樂顆粒所含垂盆草中3種成分分別進(jìn)行定量測(cè)定研究，但因該制劑中異鼠李素含有量偏低，所采用的色譜條件下異鼠李素與其他成分分離效果不佳，故本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)垂盆草中槲皮素和山柰素進(jìn)行了定量控制，未將異鼠李素作為該制劑定量控制指標(biāo)。

3.2 ELSD是一種通用型檢測(cè)器， 流動(dòng)相由熱氣流使之熱氣化噴霧，再進(jìn)入加熱管，溶劑在此揮發(fā)。所得分析檢測(cè)的物質(zhì)顆粒通過一狹窄光束散射光， 由光電倍增管收集。 ELSD的響應(yīng)取決于被分析物質(zhì)顆粒的數(shù)量和大小。 由于 ELSD僅對(duì)不揮發(fā)被分析物質(zhì)產(chǎn)生響應(yīng).即使是在梯度洗脫時(shí)也能提供平衡的基線。 ELSD已成功用于皂苷、 生物堿、萜類內(nèi)酯、氨基酸和糖類等分析，是分析無紫外吸收及紫外吸收弱成分的有力工具。柴胡為方中主要藥物之一，具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽(yáng)氣之功效，可用于感冒發(fā)熱，寒熱往來，胸脅脹痛，月經(jīng)不調(diào)，子宮脫垂，脫肛等癥狀的治療；同時(shí)柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為柴胡的主要成分。 本實(shí)驗(yàn)采用 HPLC-ELSD法對(duì)柴胡中柴胡皂苷 a、 柴胡皂苷 d進(jìn)行測(cè)定方法研究，為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供重要依據(jù)。

［ 1 ］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典： 2010 年版一部［S］.北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2010： 198-199， 263-264， 附錄 30， 附錄36.

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Determ ination of quercetin， kaemp ferol， saikosaponin a and saikosaponin d in Yiganle Granules by HPLC-UV-ELSD

TAN Xiong-si
（Zhaoqing Medical College， Zhaoqing 526020， China）

AIM To develop an HPLC-UV-ELSD method for determining the content of quercetin， kaempferol， saikosaponin a and saikosaponin d in Yiganle Granules（Sedi Herba， Bupleuri Radix，Isatidis Radix， etc.） . METHODS An Hypersil C18column was used as the chromatographic column，the flow rate was 0.8 mL/min. Themobile phase for quercetin and kaempferol consisted ofmethanol-water-trifluoroacetic acid （40 ∶60 ∶0.05 ） . The UV detection wavelength was set at360 nm.Themobile phase for saikosaponin a and saikosaponin d consisted ofmethanol-acetonitrile-water（ 25 ∶45 ∶30 ），the temperature of drift tube was set at 95 ℃， and the gas flow（ N2） at2.4 SLPM/min.RESULTS Therewas a good linear relationship between the concentration ofquercetin，kaempferol and peak area value at the concentrations of0.071 3-1.426 μg（r=0.999 7） ， and 0.056 8-1.136 μg（ r=0.999 3） .The average recovery were 97.73% （ RSD=1.63%） and 96.97% （RSD=1.52%）， respectively.There was a good linear relationship in the concentrations of saikosaponin a and saikosaponin d at the concentration of0.041 6-0.832 0 μg（r=0.999 2）， 0.026 7-0.534 0 μg（r=0.999 5）.The average recoveries were 97.35% （RSD=0.81%） and 98.04% （ RSD=1.16%） ， respectively.CONCLUSION The method is accurate， sensitive， reproducible and can be used in the determination of quercetin， kaempferol， saikosaponin a and saikosaponin d in Yiganle Granules.

Yiganle Granules；quercetin； kaempferol； saikosaponin a； saikosaponin d

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）03-0531-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.018

2013-06-08

譚雄斯 （1979—） ， 男， 碩士， 藥師， 主要從事藥學(xué)教育和研究。 Tel： 13450185366， E-mail： tanxiongsi2013@163.com