葛黃神箭片長期給藥的安全性評價

謝家駿， 張國明， 喬正東， 阮克鋒

（1.上海中醫(yī)藥大學， 上海 201203； 2.上海市中藥研究所， 上海 201401； 3.上海市浦東醫(yī)院， 上海201399）

葛黃神箭片長期給藥的安全性評價

謝家駿1， 張國明2， 喬正東3， 阮克鋒1

（1.上海中醫(yī)藥大學， 上海 201203； 2.上海市中藥研究所， 上海 201401； 3.上海市浦東醫(yī)院， 上海201399）

目的 觀察葛黃神箭片 （葛根總黃酮、 黃柏總生物堿和鬼箭羽水提物） 長期給藥對大鼠的毒性反應。 方法SD大鼠 128 只， 隨機分成 4 組。 給藥組分別灌服葛黃神箭片 4.37、 1.94、 0.73 g/kg， 對照組同法給予等容量蒸餾水，連續(xù)給藥27 周， 恢復期4周， 每周稱體質(zhì)量和食耗量， 在給藥和恢復期間， 取血檢測血液、 凝血、 血清生化、 電解質(zhì)等指標，主要臟器稱定質(zhì)量，并作組織病理學檢查。結(jié)果 葛黃神箭片灌胃給藥，可使大鼠耗食量減少，體質(zhì)量增長緩慢，總膽固醇降低，還可使雌性大鼠子宮腔擴張，子宮內(nèi)膜水腫、上皮脫落、核碎裂，乳腺導管擴張等。但上述反應可能與其藥性、主要藥效學活性以及富含葛根素等異黃酮類成分有關(guān)。結(jié)論 葛黃神箭片經(jīng)口長期給藥的安全劑量為 4.37 g/（kg·d）， 相當于臨床推薦劑量的 90 倍。 但對于育齡期婦女， 建議就其長期給藥的雌激素樣作用作進一步觀察。

葛黃神箭片；大鼠，長期毒性試驗；安全劑量；雌激素樣作用

葛黃神箭湯是中醫(yī)臨床經(jīng)驗方，具有滋陰清火的功效，可用于中輕度Ⅱ型糖尿病的預防和治療。葛黃神箭片是采用現(xiàn)代提取純化工藝制備而成的中成藥制劑，由 葛根總 黃酮［1-2］、 黃 柏總生 物 堿［3-4］、鬼箭羽水提物［5-6］按一定 比例組合而成。 根 據(jù)作為糖尿病治療藥物的臨床使用特性，探索其長期給藥可能產(chǎn)生的毒性反應及其性質(zhì)、程度、量效和時效關(guān)系、可逆性，推測臨床毒性靶器官或靶組織，推測臨床使 用 安 全劑 量 是 非常 有 必 要 的［7-8］。 為 此，本實驗就其長期給藥可能產(chǎn)生的毒性反應進行實驗觀察，對長期用藥的安全劑量范圍予以客觀評判。

1 材料

1.1 受試物 葛黃神箭片， 呈棕黃色粉末， 1 g相當生藥13.4 g， 由上海市中藥研究所制備和提供，批號 20080610。 其制備工藝首先將藥材葛根和黃柏破碎或切成塊狀，用稀醇提取，提取液上大孔樹脂，以不同體積分數(shù)醇水溶液洗脫，洗脫液減壓濃縮，真空干燥得葛根總黃酮與黃柏總生物堿的混合物，然后與鬼箭羽水提物按一定比例混合而成。其中，總黃酮的量以質(zhì)量分數(shù)表示為 14.6%， 總生物堿的量以質(zhì)量分數(shù)表示為 39.8%。 試驗時用蒸餾水將受試物配制成 0.336 g粉/mL、 0.149 g粉/mL，0.075 g粉/mL的混懸液， 備用。

1.2 實驗動物 SPF級 SD大鼠，雌雄各半， 5 ～6周齡， 體質(zhì)量 60 ～70 g， 由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提 供， 動物生產(chǎn)許 可 證 號： SCXK（滬） 2007-0005。 入室后飼以60Co輻 照鼠顆粒飼料，飼料亦由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。 自由飲食、 飲水。 置 SPF級實驗室飼養(yǎng)， 溫度 20 ～25 ℃， 相對濕度 40% ～70%， 噪聲≤60 dB， 換氣次數(shù) 10 ～20 次/h， 工作照度 12 h 明 12 h暗。

1.3 主要儀器 BAYER ADVIA 120 五分類血球儀（德國拜耳公司產(chǎn)品）； OPTION4plus血凝儀 （ 法國BioMerieux公司）； 日立 7080 全 自 動 生 化 分 析 儀（日本日立貿(mào)易有限公司）； BD FACSCalibur流式細胞儀 （ 美國 BD Bioscience公司） ； ACS-6A電子秤 （上海實業(yè)衡器有限公司）； JH2102 型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）； AR2130 型電子精密天平 （奧豪斯上海公司產(chǎn)品）。

1.4 主要試劑 血液生化檢測試劑盒 （上海日和貿(mào)易有限公司）； 離子檢測試劑盒 （上海迅達醫(yī)療儀器有限公司）； 血液學檢測試劑盒 （上海百徠生物制品有限公司）； 凝血指標測定試劑盒 （上海太陽生物技術(shù)有限公司）； 烏來糖 （國藥集團化學試劑有限公司， 批號 T20061101）。

2 試驗方法［1-2］

2.1 動物分組 128 只健康動物按體質(zhì)量分層隨機進行分組，分成對照組、葛黃神箭高劑量組（4.37 g/kg）、 中劑量組 （1.94 g/kg） 和低劑量組（0.73 g/kg）， 每組 32 只，雌雄各半。其中高劑量為可灌胃的最高質(zhì)量濃度和最大容量，低劑量高于藥效最低有效劑量，高、中、低劑量分別相當于人臨床推薦劑量 90、 40、 15 倍。 對照組給予等容量蒸餾水。采用灌胃給藥， 單次劑量為 13 mL/kg，1 次/d，每周給藥 6 d，連續(xù)給藥 6 個月。

2.2 檢測項目

2.2.1 一般癥狀 給藥期和停藥后恢復期， 除周日外，每天觀察1次外觀、體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、皮毛、糞、尿等，每周稱體質(zhì)量和攝食量1次，發(fā)現(xiàn)死亡或瀕死動物及時尸檢。

2.2.2 血液學檢測 紅細胞計數(shù) （RBC）、 血紅蛋白 （HGB）、 白細胞計數(shù) （WBC）、 紅細胞容積（HCT）、 平均紅細胞容積 （MCV）、 平均紅細胞血紅蛋白 （MCH）、 平 均紅細胞血 紅 蛋 白 濃 度（MCHC）、 血小板計數(shù) （PLT）、 網(wǎng)織紅細胞百分率 （RETIC）、 中性粒細胞百分率 （NEUT）、 淋巴細 胞 百 分 率 （ LYMPH）、單 核 細 胞 百 分 率（MONO）、 嗜酸細胞百分率 （EOS）、 嗜堿細胞百分率 （BASO）。 胸骨取骨髓涂片， 甲醛固定。

2.2.3 血液生化檢測 天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （AST，谷草轉(zhuǎn)氨酶法）、 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶 （ALT， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑法）、 堿性磷酸酶 （ALP， 酶法）、 尿素氮 （BUN， 酶法）、 肌酐 （CREAT， 苦味酸法）、總蛋白 （TP， 雙縮脲法）、 白蛋白 （ALB， 溴甲酚緑法）、 血糖 （GLU， 葡萄糖脫氫酶法）、 總膽紅素 （TB， 釩酸氧化法）、 總膽固醇 （CHOLT， 酶法）、 甘油三脂 （TG， 酶法）、 肌酸激酶 （CK， 酶法），鈉、鉀、氯離子。

2.2.4 凝血指標檢測 凝血酶原時間 （PT）、 活化部分凝血活酶時間 （APTT）。

2.2.5 系統(tǒng)尸檢和病理組織學檢查 取各組大鼠腦、 垂體、 脊髓 （頸、胸、 腰段）、 胸腺、 甲狀腺、唾液腺、食管、胃、大腸和小腸、肝、脾、腎上腺、腎、淋巴結(jié) （食管淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)）、胰腺、氣管、肺、心、 主動脈、 膀胱、 坐骨神經(jīng)、胸骨、雄性動物睪丸、附睪、前列腺、或雌性動物乳腺、子宮、卵巢及尸檢時肉眼發(fā)現(xiàn)的可疑臟器， 放入 10%福爾馬林固定， HE染色。 高劑量組和對照組的器官和組織進行組織病理學檢查，如果高劑量組出現(xiàn)組織病理學變化時，更低劑量組也應進行組織病理學檢查以確定劑量-反應關(guān)系。其中取材后需稱定質(zhì)量的器官：腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪或子宮、卵巢。 計算各臟器指數(shù) （g/100 g體質(zhì)量）。

2.3 檢測頻率 大鼠在給藥 3 個月、6 個月和停藥28 d后均進行血液學、 血液生化學、 凝血指標檢查。 在給藥 3、 6 個月及停藥后 30 d， 每組各解剖 8、 16、8 只大鼠， 雌雄各半。

2.4 統(tǒng)計方法 本試驗所有數(shù)據(jù)均采用 spss 13.0軟件統(tǒng)計，各給藥組與對照組進行比較，多組間比較用單因素方差分析， 方差齊性時用 LSD及 SNK方法分析，方差不齊時用非參數(shù)檢驗。

3 試驗結(jié)果

3.1 一般癥狀 大鼠給藥 6 個月及恢復期內(nèi)， 對照組和各給藥組大鼠精神狀態(tài)良好，行為活動、呼吸正常，唾液腺、淚腺等腺體未見有異常分泌，皮毛光滑，糞便和尿液也未見異常。

3.2 體質(zhì)量和食耗量 自給藥 4 周起， 各劑量組雌雄性大鼠體質(zhì)量增長開始減緩，食耗量逐步下降。其中高劑量組大鼠最甚，中劑量次之，低劑量最小， 呈明顯的量效關(guān)系。結(jié)果見圖 1， 圖 2。

圖1 葛黃神箭片給藥 6個月大鼠體質(zhì)量的經(jīng)時變化Fig.1 Effect of Gehuang Shenjian Tab lets on the changes of body weight of rats w ithin six mon ths

圖2 葛黃神箭片給藥6個月大鼠食耗量的經(jīng)時變化Fig.2 Effect of Gehuang Shenjian Tab lets on the changes of food consum p tion of ratsw ithin six months

3.3 血液學 給藥 3 個月、6 個月及恢復期末，各給藥組血液學指標與對照組比較無明顯差異。

3.4 血液生化 給藥 3 個月， 中劑量組 ALP偏高（P＜0.01）， 高、 中、 低 各 給 藥 組 CHOLT偏 低（P＜0.05 或 P＜0.01）； 給藥 6 個月， 低劑量組 CK偏高 （P＜0.01）， 高、中、 低各給藥組 CHOLT偏低 （P＜0.01）； 恢復 期末， 高劑 量組 ALT偏 低（P＜0.01）； 其余各給藥組的血液生化各項指標與對照組比較未見明顯差異。結(jié)果見表1。

3.5 凝血指標 給藥 3 個月、 6 個月及恢復期末，各給藥組各項凝血指標與對照組比較未見明顯差異。

表1 葛黃神箭片對大鼠血液生化學指標的影響 （）Tab.1 Effect of Gehuang Shenjian Tab lets on serum biochem ical indexes of rats（）

表1 葛黃神箭片對大鼠血液生化學指標的影響 （）Tab.1 Effect of Gehuang Shenjian Tab lets on serum biochem ical indexes of rats（）

注： 與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

項目 對照組 高劑量組 中劑量組 低劑量組（給藥3個月）AST/（IU/L） 104 ±22 99 ±19 123 ±49 108 ±29 ALT/（IU/L） 44 ±12 41 ±7 53 ±20 45 ±14 ALP/（ IU/L） 213 ±43 258 ±62 286 ±49** 213 ±31 BUN/（mmol/L） 7.8 ±0.8 7.1 ±0.8 7.4 ±1.0 6.8 ±0.7 CREAT/（μmol/L） 37 ±6 36 ±3 36 ±7 36 ±5 TP/（g/L） 58.1 ±3.4 58.4 ±3.2 60.0 ±3.4 58.3 ±2.9 ALB/（g/L） 32.6 ±2.0 32.8 ±1.7 33.0 ±1.8 32.1 ±1.6 GLU/（mmol/L） 7.86 ±1.07 7.65 ±1.48 7.16 ±1.20 7.86 ±1.38 TB/（ μmol/L） 0.66 ±0.16 0.82 ±0.22 0.73 ±0.18 0.87 ±0.23 CHOLT/（ mmol/l） 1.96 ±0.48 1.44 ±0.25* 1.57 ±0.30* 1.27 ±0.45**TRIG/（ mmol/l） 0.74 ±0.51 0.87 ±0.45 0.75 ±0.48 1.04 ±0.39 CK/（IU/L） 1 068 ±448 1 059 ±660 1 515 ±1 094 841 ±270 Na+/（mmol/L） 134.2 ±7.3 134.3 ±7.3 133.6 ±7.1 132.9 ±7.3 K+/（mmol/L） 4.48 ±0.65 4.78 ±0.52 4.72 ±0.50 4.49 ±0.30 Cl-/（mmol/L） 107.9 ±4.2 109.2 ±3.4 109.3 ±4.2 109.9 ±3.2（給藥6個月）AST/（IU/L） 125 ±62 113 ±38 106 ±31 110 ±28 ALT/（IU/L） 75 ±39 73 ±73 59 ±24 60 ±18 ALP/（IU/L） 217 ±82 252 ±76 216 ±70 218 ±49 BUN/（mmol/L） 7.2 ±1.4 7.4 ±1.4 7.9 ±1.7 7.3 ±0.9 CREAT/（μmol/L） 35 ±8 39 ±7 38 ±7 38 ±7 TP/（g/L） 62.0 ±4.7 61.7 ±5.2 61.0 ±4.1 60.1 ±4.4 ALB/（g/L） 31.2 ±2.7 31.3 ±2.1 30.6 ±2.1 30.4 ±2.7 GLU/（mmol/L） 9.66 ±3.70 8.39 ±1.27 8.67 ±2.01 8.79 ±1.42 TB/（ μmol/L） 0.68 ±0.50 0.94 ±0.60 0.70 ±0.41 0.56 ±0.32 CHOLT/（ mmol/L） 2.17 ±0.25 1.15 ±0.36** 1.29 ±0.39** 1.52 ±0.57**TRIG/（mmol/L） 1.36 ±1.39 0.78 ±0.48 0.95 ±0.43 0.84 ±0.36 CK/（ IU/L） 837 ±811 1 244 ±569 1 140 ±635 1 603 ±1 045**Na+/（mmol/L） 141.4 ±1.8 141.3 ±1.6 141.1 ±1.7 141.2 ±1.7 K+/（mmol/L） 4.64 ±0.82 4.44 ±0.86 4.51 ±0.99 4.34 ±0.53 Cl-/（mmol/L） 107.7 ±2.6 107.9 ±1.9 107.6 ±1.8 108.1 ±1.7（恢復期末）AST/（IU/L） 142 ±117 94 ±21 101 ±29 111 ±38 ALT/（IU/L） 70 ±13 46 ±7** 73 ±32 61 ±10 ALP/（IU/L） 176 ±68 139 ±68 186 ±102 161 ±77 BUN/（mmol/L） 7.1 ±0.7 9.1 ±2.4 8.8 ±1.8 7.5 ±1.1 CREAT/（μmol/L） 39 ±4 49 ±22 43 ±8 44 ±9 TP/（g/L） 61.3 ±5.3 61.7 ±5.7 61.3 ±5.5 60.7 ±4.4 ALB/（g/L） 30.7 ±3.1 31.0 ±3.3 30.7 ±2.3 30.3 ±2.5 GLU/（mmol/L） 9.55 ±1.06 8.86 ±1.25 10.11 ±3.76 8.37 ±1.50 TB/（ μmol/L） 0.77 ±0.28 0.75 ±0.23 0.58 ±0.14 0.60 ±0.17 CHOLT/（mmol/L） 2.02 ±0.33 1.97 ±0.46 1.96 ±0.35 2.03 ±0.42 TRIG/（mmol/L） 1.28 ±0.60 0.79 ±0.47 1.21 ±1.24 0.91 ±0.78 CK/（IU/L） 1 603 ±2 147 913 ±511 973 ±516 1 186 ±865 Na+/（mmol/L） 144.8 ±1.6 144.2 ±1.1 144.6 ±1.2 144.6 ±1.0 K+/（mmol/L） 4.70 ±0.63 4.36 ±0.61 4.60 ±0.55 4.47 ±0.62 Cl-（mmol/L）107.6 ±2.4 107.0 ±1.6 108.8 ±2.2 108.4 ±1.7

3.6 臟器質(zhì)量

3.6.1 臟器濕質(zhì)量 除給藥 6 個月高劑量組雌雄大鼠肺、腎、卵巢濕質(zhì)量偏低、附睪濕質(zhì)量偏高（P＜0.05 或 P＜0.01） 外，其余各給藥組雌雄大鼠臟器濕質(zhì)量與對照組比較均無明顯差異。

3.6.2 臟器指數(shù) 給藥 3 個月， 雄性大鼠高劑量組肺、腎、附睪指數(shù)、中劑量組肺、腎指數(shù)、低劑量組肺、 附睪指數(shù)升高 （P＜0.05 或 P＜0.01），雌性大鼠中劑量組肝指數(shù)升高 （P＜0.05）； 給藥6個月，雄性大鼠高劑量組心、肺、腎、附睪指數(shù)、中劑量組腦、肺、腎、腎上腺、睪丸指數(shù)、低劑量組腦、 睪丸指數(shù)偏高 （P＜0.05 或 P＜0.01）； 雌性大鼠各劑量組腦、心、肝、腎指數(shù)偏高 （P＜0.01）； 恢復期末， 雄性大鼠高劑量組肺、 腎上腺、附睪指數(shù)、中劑量組腎上腺指數(shù)、低劑量組腎上腺、 附睪指數(shù)偏高 （P＜0.05 或 P＜0.01）； 雌性大鼠各劑量組腦、 心、 腎指數(shù)均偏高 （P＜0.01或 P＜0.05）， 高劑量組卵巢指數(shù)偏低 （P＜0.05或 P＜0.01）。 其余各給藥組臟器指數(shù)與對照組比較均無明顯差異。 見表 2， 表 3。

表2 葛黃神箭片對雄性大鼠主要臟器指數(shù)的影響 （， g/100 g）Tab.2 Effect of Gehuang Shenjian Tablets on organ coefficients of themale rats（， g/100 g）

表2 葛黃神箭片對雄性大鼠主要臟器指數(shù)的影響 （， g/100 g）Tab.2 Effect of Gehuang Shenjian Tablets on organ coefficients of themale rats（， g/100 g）

注： 與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

項目 對照組 高劑量組 中劑量組 低劑量組（給藥3個月）0.387 ±0.021 0.418 ±0.040 0.447 ±0.053 0.399 ±0.040胸腺 0.065 ±0.012 0.067 ±0.023 0.055 ±0.013 0.054 ±0.018肝2.785 ±0.260 2.971 ±0.165 2.989 ±0.119 2.854 ±0.341脾0.155 ±0.019 0.161 ±0.008 0.174 ±0.015 0.183 ±0.047腎上腺 0.011 ±0.001 0.011 ±0.002 0.012 ±0.003 0.012 ±0.002腎0.562 ±0.058 0.675 ±0.056** 0.698 ±0.019** 0.627 ±0.018肺0.332 ±0.008 0.364 ±0.012* 0.366 ±0.011** 0.355 ±0.023*心0.303 ±0.017 0.299 ±0.030 0.315 ±0.049 0.293 ±0.022睪丸 0.707 ±0.046 0.787 ±0.155 0.769 ±0.158 0.720 ±0.089附睪 0.219 ±0.018 0.298 ±0.033* 0.265 ±0.067 0.250 ±0.005*（給藥6個月）腦0.309 ±0.020 0.424 ±0.014** 0.377 ±0.032** 0.355 ±0.019**胸腺 0.039 ±0.009 0.045 ±0.012 0.043 ±0.010 0.032 ±0.008肝2.730 ±0.285 2.915 ±0.183 2.771 ±0.225 2.712 ±0.239脾0.149 ±0.020 0.160 ±0.020 0.145 ±0.020 0.141 ±0.016腎上腺 0.009 ±0.001 0.011 ±0.002* 0.011 ±0.001** 0.009 ±0.002腎0.533 ±0.049 0.636 ±0.049** 0.601 ±0.068* 0.583 ±0.060肺0.296 ±0.017 0.363 ±0.047** 0.342 ±0.023** 0.327 ±0.028心0.281 ±0.019 0.320 ±0.035* 0.293 ±0.032 0.290 ±0.025睪丸 0.508 ±0.111 0.686 ±0.123** 0.641 ±0.054** 0.615 ±0.044*附睪 0.226 ±0.030 0.275 ±0.033** 0.254 ±0.026 0.233 ±0.029（恢復期末）腦0.304 ±0.032 0.367 ±0.039 0.368 ±0.042 0.349 ±0.043胸腺 0.028 ±0.010 0.031 ±0.009 0.027 ±0.011 0.040 ±0.016肝2.756 ±0.202 2.774 ±0.269 2.912 ±0.301 2.618 ±0.223脾0.153 ±0.028 0.146 ±0.019 0.134 ±0.007 0.140 ±0.010腎上腺 0.007 ±0.001 0.009 ±0.000** 0.009 ±0.001* 0.009 ±0.001**腎0.538 ±0.020 0.591 ±0.044 0.581 ±0.063 0.563 ±0.033肺0.287 ±0.014 0.362 ±0.032** 0.332 ±0.033 0.277 ±0.044心0.260 ±0.022 0.316 ±0.032 0.265 ±0.019 0.317 ±0.059睪丸 0.542 ±0.067 0.673 ±0.125 0.631 ±0.072 0.611 ±0.043附睪 0.193 ±0.017 0.278 ±0.028* 0.242 ±0.066 0.233 ±0.024腦*

3.7 病理組織學

3.7.1 大體病理學檢查 給藥 3 個月： 各劑量組和對照組動物臟器未見明顯異常。給藥6個月：高劑量組有 1 只動物 （No.40） 頸部皮下及食管、 氣管周圍軟組織出血，波及胸腺被膜；1只動物（No.59） 胸腺明顯萎縮， 右側(cè)頸部可見 1 cm×1 cm ×0.3 cm 的 白 色 質(zhì) 軟 腫 塊；1 只 動 物（No.58） 兩側(cè)肺尖部可見數(shù)個黃白色斑點。 對照組 有 1 只 動 物 （No.7 ） 右 側(cè) 睪 丸 缺 如 （ monoorchidism），附睪無異常。 高劑量組有 6 只動物（No.54、 55、 56、 58、 59、 60）， 中劑量組 1 只動物 （No.87）， 低劑量組 2 只動物 （No.121、 124）兩側(cè)子宮角擴張，宮腔內(nèi)有透明液體內(nèi)容物。其余動物體表及臟器未見明顯異常?；謴推冢焊邉┝拷M有 1 只動物 （No.46） 胃腸輕度脹氣；中劑量組 1只動物 （No.94）、 低劑量組 1 只動物 （ No.127）胸腺輕度萎縮。 對照組有 1 只動物 （No.30） 左胸部皮下腫瘤，1 cm×1 cm×2 cm， 淡黃色，質(zhì)軟，邊界清晰，活動度好。其余動物的體表及臟器未見明顯異常。

表3 葛黃神箭片對雌性大鼠主要臟器指數(shù)的影響 （， g/100 g）Tab.3 Effect of Gehuang Shenjian Tablets on organ coefficients of the female rats（， g/100 g）

表3 葛黃神箭片對雌性大鼠主要臟器指數(shù)的影響 （， g/100 g）Tab.3 Effect of Gehuang Shenjian Tablets on organ coefficients of the female rats（， g/100 g）

注： 與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

項目 對照組 高劑量組 中劑量組 低劑量組（給藥3個月）0.699 ±0.040 0.683 ±0.066 0.744 ±0.030 0.682 ±0.068胸腺 0.088 ±0.009 0.112 ±0.016 0.086 ±0.020 0.102 ±0.023肝2.758 ±0.210 3.127 ±0.111 3.451 ±0.288** 2.954 ±0.187脾0.194 ±0.009 0.191 ±0.031 0.194 ±0.015 0.201 ±0.015腎上腺 0.022 ±0.006 0.022 ±0.006 0.024 ±0.003 0.026 ±0.006腎0.617 ±0.043 0.651 ±0.025 0.665 ±0.040 0.657 ±0.042肺0.470 ±0.033 0.473 ±0.026 0.510 ±0.034 0.479 ±0.026心0.324 ±0.018 0.344 ±0.009 0.340 ±0.024 0.318 ±0.033子宮 0.256 ±0.072 0.263 ±0.052 0.274 ±0.065 0.218 ±0.075卵巢 0.053 ±0.004 0.050 ±0.006 0.045 ±0.004 0.047 ±0.005（給藥6個月）腦0.606 ±0.101 0.719 ±0.055** 0.727 ±0.073** 0.687 ±0.063*胸腺 0.054 ±0.011 0.049 ±0.016 0.054 ±0.008 0.052 ±0.016肝2.599 ±0.307 3.141 ±0.195** 3.047 ±0.182** 3.057 ±0.423**脾0.159 ±0.027 0.185 ±0.020 0.190 ±0.027 0.186 ±0.030腎上腺 0.021 ±0.004 0.021 ±0.003 0.023 ±0.003 0.020 ±0.004腎0.566 ±0.037 0.625 ±0.056* 0.640 ±0.043** 0.633 ±0.027**肺0.421 ±0.067 0.473 ±0.043 0.467 ±0.038 0.460 ±0.017心0.299 ±0.030 0.338 ±0.017** 0.333 ±0.015** 0.330 ±0.022**子宮 0.043 ±0.008 0.045 ±0.012 0.046 ±0.006 0.040 ±0.011卵巢 0.266 ±0.101 0.397 ±0.130 0.369 ±0.206 0.344 ±0.122（恢復期末）腦0.602 ±0.060 0.694 ±0.025** 0.735 ±0.020** 0.698 ±0.044**胸腺 0.053 ±0.021 0.056 ±0.014 0.045 ±0.015 0.044 ±0.018肝2.542 ±0.178 2.934 ±0.093 2.845 ±0.278 2.704 ±0.211脾0.165 ±0.020 0.177 ±0.019 0.186 ±0.020 0.170 ±0.032腎上腺 0.018 ±0.003 0.022 ±0.001 0.021 ±0.003 0.020 ±0.002腎0.548 ±0.046 0.657 ±0.039* 0.632 ±0.052* 0.641 ±0.060*肺0.446 ±0.032 0.488 ±0.047 0.478 ±0.028 0.482 ±0.020心0.294 ±0.027 0.349 ±0.016* 0.350 ±0.028** 0.361 ±0.028**子宮 0.290 ±0.062 0.379 ±0.044 0.318 ±0.057 0.332 ±0.127卵巢 0.043 ±0.006 0.034 ±0.005*腦0.049 ±0.007 0.046 ±0.003

3.7.2 組織病理學檢查 給藥 3 個月， 高劑量組有部分動物肺、肝、胰腺出現(xiàn)病理改變，分別為5、 3、 1 只， 對照組心、 肺、 肝、 胰腺出現(xiàn)病理改變動物數(shù)分別為 1、 3、 2、 1 只， 其病理改變主要特征為右心房壁肌層炎性細胞浸潤灶；肺內(nèi)血管周圍炎細胞浸潤及泡沫細胞聚集，氣管腺體擴張；肝細胞微空泡化及脂肪變性，肝內(nèi)微肉芽腫；胰腺導管增生，腸管擴張；垂體內(nèi)的異位性顱咽管組織、膀胱黏膜水腫；前列腺炎等。給藥6個月，高劑量組有部分動物肺、肝、睪丸、胸腺、子宮出現(xiàn)病理改變， 分別為 3、 1、 1、 8、 7 只， 對照組心、 肺、肝、腎、垂體、睪丸、胸腺出現(xiàn)病理改變數(shù)分別為2、 1、3、 1、 1、 1、 4 只，其病理改變主要特征為右心室壁肌層灶性纖維化伴炎癥細胞浸潤；肺內(nèi)血管周圍炎細胞浸潤，支氣管肺炎，氣管腺腺管擴張；肝細胞微空泡化及脂肪變性；垂體內(nèi)的異位性顱咽管組織；甲狀腺鰓后體殘留；腎小管上皮嗜堿性變；膀胱黏膜水腫；睪丸內(nèi)局限性生精小管萎縮；前列腺炎；乳腺纖維腺瘤；子宮內(nèi)膜炎、內(nèi)膜水腫、內(nèi)膜上皮核碎裂，子宮腔擴張?；謴推谀焊邉┝拷M有部分動物心、肺、肝、腎、甲狀腺、垂體、胸腺、乳腺、 子宮出現(xiàn)病理改變， 分別為 2、3、 2、 1、 3、 1、 1、 1、 3 只， 對照組心、 肺、 肝、腎、甲狀腺、胸腺、乳腺出現(xiàn)病理改變動物數(shù)為2、 2、2、 1、 3、 1、 1 只，其病理改變主要特征為心肌內(nèi)灶性纖維化及單核細胞灶性浸潤；肺內(nèi)血管周圍炎細胞浸潤，肺泡內(nèi)泡沫細胞；胃底腺擴張；肝細胞微空泡化及脂肪變性； 垂體內(nèi) Rathke’ s囊泡；胰島纖維化；甲狀腺鰓后體殘留，甲狀腺濾泡內(nèi)單核細胞；腎小管上皮細胞內(nèi)嗜酸性顆粒，腎小管嗜堿性變，腎間質(zhì)內(nèi)灶性炎細胞浸潤；前列腺炎；乳腺腺癌；子宮內(nèi)膜炎、內(nèi)膜水腫，內(nèi)膜上皮核碎裂，子宮腔擴張等。上述病理變化均散在出現(xiàn)，有的雖然僅見于高劑量組，但為單發(fā)性，因此認為這些變化系動物的自發(fā)、偶發(fā)或非特異性病理改變，均與受試藥物沒有明顯關(guān)系。給藥6個月高劑量組 1 只動物 （No.14） 氣管、 食管周圍軟組織出血伴肉芽組織形成的原因不詳，可能與機械損傷等因素有關(guān)；給藥6個月和恢復期末出現(xiàn)的胸腺退縮屬大鼠的生理性改變；肺出血可能與處死時應激反應有關(guān)；各劑量用藥組雌性動物子宮內(nèi)膜的變化和高劑量組乳腺變化可能因藥物中所含某種成分的類激素樣作用所致。 見表 4，表 5。

表4 葛黃神箭片對大鼠主要臟器組織形態(tài)學的影響 （出現(xiàn)臟器病理改變動物數(shù)）Tab.4 Effect of Gehuang Shenjian Tablets on the morphology of main organs of rats（ organ pathological changes animal number）

表5 葛黃神箭片對大鼠子宮組織形態(tài)學的影響 （出現(xiàn)子宮病理改變動物數(shù)）Tab.5 Effect of Gehuang Shenjian Tablets on them orphology changes of uterine tissue of rats（u terus pathological changes animal number）

4 討論

祖國醫(yī)學在治療糖尿病方面有著悠久的歷史，在眾多的醫(yī)書和民間中隱藏著不少療效確切、表本兼治的寶貴處方，雖然受限于當時的科學技術(shù)水平，其中有不盡完善之處，但隨著現(xiàn)代科學的高速發(fā)展、研究手段的不斷提高，從中藥或民間草藥中整理、發(fā)掘療效確切、安全性好的防治糖尿病的處方，并在此基礎(chǔ)上將其研發(fā)成為現(xiàn)代藥物制劑已成為可能。所以，研究注重治本、標本兼治、或以調(diào)節(jié)機體整體平衡為特色的預防和治療糖尿病及其并發(fā)癥的中藥驗方或民間秘方，并在此基礎(chǔ)上，采用現(xiàn)代技術(shù)和手段，提取其中各個活性部位進行藥效活性篩選和安全性評估，根據(jù)不同活性部位對療效的協(xié)同作用進行科學組方，進而開發(fā)成具有鮮明療效特點、以中藥有效部位群為物質(zhì)基礎(chǔ)的現(xiàn)代中藥復方制劑，已成為現(xiàn)代中藥復方制劑研發(fā)的方向之一［9］。

葛黃神箭片源于葛黃神箭湯，由葛根總黃酮、黃柏總生物堿、鬼箭羽水提物等有效部位按一定比例組合而成，具有滋陰清火的功效，主治中輕度Ⅱ型糖尿病。前期主要藥效學研究顯示，葛黃神箭片具有刺激胰島B細胞分泌胰島素，增加胰島素受體的敏感性，抑制糖水解酶活性，改善脂質(zhì)代謝的藥效活性，對蛋白質(zhì)非酶糖基化反應和醛糖還原酶活性亦有一定的抑制作用。在此基礎(chǔ)上，本實驗就其長期給藥的安全性進行評判。

葛黃神箭片自給藥2周起，各劑量組動物耗食量下降，4～6周開始， 雄、 雌動物體質(zhì)量增長開始變緩，其中以高劑量組程度最甚，中劑量組次之，低劑量組再次，呈一定的量效關(guān)系；停藥后，給藥組動物耗食量下降態(tài)勢雖有所改觀，但體質(zhì)量恢復態(tài)勢不明顯。結(jié)果顯示，葛黃神箭片可致大鼠耗食量降低，體質(zhì)量增長放緩，而體質(zhì)量增長緩慢與食耗量降低顯著相關(guān)，提示該藥物引起的食耗量下降可能就是導致體質(zhì)量增長緩慢的一個主要原因。在整個給藥和恢復期間，各給藥組和對照組大鼠精神狀態(tài)良好，皮毛光滑，呼吸順暢，糞便成型，行為活動正常，血液學和凝血指標檢測均無明顯異常。 但是， 在給藥 13、 27 周時， 中劑量組ALP和高劑量組 CK偏高， 其他各劑量組 CHOLT偏低；停藥4周后，各指標均恢復正常。經(jīng)對生化指標出現(xiàn)異常的動物心、肝組織進行形態(tài)學檢查，結(jié)果均未見有異常，故分析認為葛黃神箭片對大鼠心、 肝組織無明顯影響， 其血液 CHOLT降低可能與其降糖降脂的主要藥效學作用有關(guān)［10］， 但不排除攝食量下降因素導致的可能。

臟器濕質(zhì)量稱定質(zhì)量結(jié)果顯示， 給藥 13周，雄性各劑量組動物肺、腎、睪丸、附睪指數(shù)、雌性中、 高劑量組動物肝指數(shù)偏高；給藥 27周， 雄性各劑量組動物腦、心、肺、腎、腎上腺、睪丸、附睪指數(shù)、雌性各劑量組動物腦、心、肝、腎、子宮指數(shù)偏高；停藥4周，雄性各劑量組動物腦、心、肺、腎、腎上腺、睪丸、附睪指數(shù)、雌性各劑量組動物腦、心、肝、腎、子宮指數(shù)均偏高。但病理檢測未發(fā)現(xiàn)上述臟器 （子宮除外） 有明顯的與藥物相關(guān)的病理改變，且以臟腦比 （臟器與腦的比值）為指標，結(jié)果與對照組比較無顯著性差異，故分析認為上述各組出現(xiàn)的臟器 （子宮除外） 差異可能與給藥組體質(zhì)量較輕有關(guān)。組織形態(tài)學鏡檢顯示，在給藥 27 周及停藥 4周時， 各劑量用藥組雌性動物子宮腔擴張，子宮內(nèi)膜水腫、上皮脫落、核碎裂，高劑量組雌性動物有乳腺導管擴張等組織學變化特征，均屬典型的激素樣作用，可能為受試藥物中富含異黃酮類成分 （如受試藥物的含測成分葛根素） 等所致［11-12］。

綜上， 葛黃神箭片給大鼠灌胃 4.37、1.94、0.73 g/kg， 每日 1 次，連續(xù) 27 周，其中高劑量相當于臨床推薦劑量的90倍， 可使動物耗食量減少、體質(zhì)量增長緩慢、CHOLT降低， 高劑量還可使雌性動物發(fā)生子宮腔擴張，子宮內(nèi)膜水腫、上皮脫落、核碎裂，乳腺導管擴張等組織學變化特征。動物食耗量減少主要由于受試藥物藥性苦寒所致，進食量的減少可能導致體質(zhì)量增長緩慢； CHOLT降低屬受試藥物降糖降脂主要藥效學活性所為，子宮內(nèi)膜組織學變化則為受試藥物中富含葛根素等異黃酮類成分所致。結(jié)果提示，葛黃神箭片經(jīng)口長期給藥的安全劑量為 4.37 g/（kg·d）， 相當臨床推薦劑量的90倍。但對于育齡期婦女， 建議就其長期給藥的雌激素樣作用作進一步的臨床觀察。

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Safety evaluation of Gehuang Shenjian Tablets on rats

XIE Jia-jun1， ZHANG Guo-ming2， QIAO Zheng-dong3， RUAN Ke-feng1
（1.Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China； 2.Shanghai Institute of Chinese Materia Medica， Shanghai 200032， China； 3.Shanghai Pudong Hospital， Shanghai 201399， China）

Gehuang Shenjian Tablets； rats； chronic toxicity test； safe dosage； estrogen-like effect

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）03-0473-09

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.007

2013-09-22

國家 “十二五” 科技重大專項課題 （2011ZX09301-009）

謝 家 駿 （ 1959—） ， 男， 研 究 員， 碩 士生導 師， 研 究方向： 藥 理 毒 理學研 究 與 中 藥 新 藥。 Tel： （ 021 ） 51322395， E-mail：xiejj001@163.com