日糧中不同水平維生素C對團頭魴幼魚免疫力的影響

萬金娟劉 波戈賢平謝 駿崔素麗周 明,

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院, 無錫 214081; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 無錫 214081; 3. 上海海洋大學(xué), 上海 201306)

日糧中不同水平維生素C對團頭魴幼魚免疫力的影響

萬金娟1,2劉 波1,2戈賢平1,2謝 駿1,2崔素麗1,2周 明2,3

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院, 無錫 214081; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 無錫 214081; 3. 上海海洋大學(xué), 上海 201306)

以酪蛋白和明膠為蛋白源, 豆油為脂肪源配制團頭魴幼魚基礎(chǔ)飼料, 制成維生素C水平為0.2、33.4、65.8、133.7、251.5和501.5 mg/kg 的6種等氮等能的試驗飼料。對均重為(6.40±0.05) g的團頭魴幼魚進行為期90d的飼養(yǎng)試驗, 以血清相關(guān)免疫指標(biāo)、肝臟抗氧化指標(biāo)、三種HSPs mRNA表達以及抗病原菌能力等指標(biāo)為依據(jù), 研究Vc 對團頭魴幼魚免疫力的影響。試驗結(jié)果表明, 與對照組相比, 501.5 mg/kg Vc 試驗組能顯著提高血清補體3 (C3)的濃度, 133.7 mg/kg Vc 試驗組能顯著提高補體4 (C4)的濃度; 65.8、133.7和251.5 mg/kg Vc 試驗組能顯著提高肝臟超氧化物歧化酶(SOD)的活性, 各Vc 試驗組均能顯著提高肝臟抗超氧陰離子(ASAFR)的活性; 133.7和251.7 mg/kg Vc 試驗組能顯著提高肝臟HSP60基因表達水平, 251.5 mg/kg Vc試驗組能顯著提高肝臟HSP70和HSP90基因表達水平(P＜0.05); 各Vc 試驗組魚的成活率在感染嗜水氣單胞菌后12h、24h均顯著高于對照組(P＜0.05), 其中以251.5 mg/kg Vc 試驗組效果最佳。在日糧中添加Vc 對魚體血清堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、皮質(zhì)醇(COR)以及肝臟丙二醛(MDA)的水平無顯著影響(P＞0.05)。綜上所述, 在試驗條件下, Vc 作為免疫刺激劑, 其水平為133.7—251.5 mg/kg時能有效地增強團頭魴幼魚的免疫力。

團頭魴; 維生素C; 非特異免疫; HSPs mRNA表達; 抗病原菌感染

在集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖條件下, 高密度養(yǎng)殖所帶來的多種多樣的應(yīng)激、種質(zhì)資源的破壞、養(yǎng)殖環(huán)境的污染等損害了養(yǎng)殖動物的防御系統(tǒng), 增加了魚類對病害的易感性, 從而嚴(yán)重制約了魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。國內(nèi)外一些學(xué)者已從免疫學(xué)角度對魚類疾病防治進行了研究, 通過應(yīng)用免疫增強劑來增加魚類自身的免疫能力, 增強機體自身免疫功能和對疾病的抵抗力[1], 從而達到防治疾病的目的, 這方面的研究工作正越來越受到人們的重視, 并在魚類疾病防治中已取得了良好的效果。維生素C (Vc )又名L-抗壞血酸(L-ascorbic acid, AA), 在魚類生長和免疫[2—5]等方面起重要作用[6]; 然而, 因為一般魚類體內(nèi)缺乏古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶而使這些種類需要在食物中添加維生素C以滿足身體對維生素C的需要[7,8]。宋學(xué)宏等[9]、Ai, et al.[8]、李桂峰等[10]、Eo & Jinee[11]分別報道了維生素C能有效地提高異育銀鯽、大黃魚、胡子鯰以及東方紅鰭豚的非特異性免疫能力以及對環(huán)境污染物、刺激物的耐受力和抗感染力。然而迄今為止, 有關(guān) Vc對團頭魴(Megalobrama amblycephala)幼魚免疫因子的影響尚未見報道。本研究擬通過分別對團頭魴幼魚投喂 Vc 含量不同的試驗飼料 90d后, 檢測其對非特異性免疫相關(guān)的幾種重要指標(biāo)、抗熱應(yīng)激蛋白以及抗病原菌力的影響, 以期得到維生素C對團頭魴幼魚免疫活性的影響規(guī)律,為魚類營養(yǎng)免疫學(xué)積累基礎(chǔ)資料, 并為維生素 C作為免疫激活劑應(yīng)用于魚類養(yǎng)殖業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚、添加劑及日糧

團頭魴幼魚由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心試驗場提供。試驗選擇體質(zhì)健壯, 規(guī)格基本一致的團頭魴魚種, 初始體重(6.40±0.05) g, 隨機分為6組, 分別為對照組及試驗組, 試驗設(shè)F0 (對照)、F1、F2、F3、F4、F5六組, 每組設(shè)3個重復(fù), 放入18個可控溫循環(huán)流水圓形蓄養(yǎng)槽(規(guī)格為φ820 mm× 700 mm)內(nèi)進行養(yǎng)殖, 每個蓄養(yǎng)槽放養(yǎng)25尾。

以酪蛋白和明膠為蛋白源, 豆油為脂肪源, 設(shè)計了6組等氮等能的飼料, 維生素C的添加水平分別為: 0、30、60、120、240和480 mg/kg飼料?；A(chǔ)飼料組成及主要營養(yǎng)成分見表 1。飼料中不同的維生素C水平是通過在飼料中添加不同劑量的包膜維生素C (95%, 羅氏公司), 制作后測定各組飼料中維生素C實際含量分別為: 0.2、33.4、65.8、133.7、251.5和501.5 mg/kg 飼料。各種原料分別充分混勻后, 用 SLP-45型膨化機(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機械儀器研究所)制成粒徑1.0 mm的沉性顆粒飼料, 50℃烘干后于4℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 飼養(yǎng)管理

團頭魴在養(yǎng)殖桶馴化22d后正式開始投喂試驗日糧。每天投喂3次, 在早上8:00至9:00投喂適量,中午11:00至12:00、下午15:00至16:00各再投喂一次。日投餌量為魚體重 2%—4%, 并根據(jù)攝食和生長情況作適當(dāng)調(diào)整, 以每次投飼后無殘餌為宜。飼養(yǎng)期間水溫27.5℃左右, pH為7.2—7.8 (正式飼養(yǎng)90d期間), 溶解氧＞5 mg/L, 氨氮＜0.01 mg/L, 硫化氫＜0.01 mg/L。減少人為干擾, 保持安靜, 防止額外應(yīng)激, 每日觀察魚攝食及死亡情況, 發(fā)現(xiàn)死魚及時撈出稱重記數(shù), 并檢查死亡原因。正式養(yǎng)殖90d后,量取魚體長、稱重和采樣等。

1.3 攻毒試驗

在飼養(yǎng)試驗結(jié)束后, 用氫氧化鈉將養(yǎng)殖槽中水從pH≈7.8調(diào)制pH≈9.5, 15d后選擇體重基本一致的團頭魴進行攻毒試驗, 每槽取6尾魚。病原菌采用實驗室的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)。按Xie, et al.[12]所述方法, 將兩次活化后的嗜水氣單胞菌用無菌生理鹽水稀釋, 使終濃度約為5×107cells/mL。按每100 g魚重腹腔注射菌液1.0 mL后, 放養(yǎng)于同樣規(guī)格的蓄養(yǎng)槽內(nèi), 并保證充足的氧氣, 觀察魚體死亡情況, 并分別于0、12、24h統(tǒng)計死亡率。

1.4 采樣與處理

在飼養(yǎng)試驗結(jié)束后, 禁食24h, 每槽隨機選取3尾體重相近的團頭魴, 每組 9尾魚, 用濃度為150 mg/L的MS-222作快速深度麻醉, 用一次性醫(yī)用注射器從尾靜脈采血, 在 4℃條件下離心制備血清, –20℃凍存?zhèn)溆?。魚體采血后立即剖開腹腔, 剝離出內(nèi)臟和肝胰臟, 取約0.1 g肝臟用液氮速凍后于–80℃保存用于分子生物學(xué)測定; 另取適量肝臟用于常規(guī)分析, 于–20℃保存。

1.5 測定指標(biāo)與方法

血液相關(guān)免疫指標(biāo)的測定 堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)和白蛋白(Alb)在深圳邁瑞B(yǎng)S-400全自動生化分析儀, 試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司; 補體 3 (C3)、補體 4 (C4)采用免疫比濁法, 試劑盒購自浙江伊利康生物技術(shù)有限公司; 皮質(zhì)醇(COR)在深圳新產(chǎn)業(yè)MAGLUMI 1000全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上測定, 試劑盒均購自深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。

肝臟抗氧化指標(biāo)的測定 在肝臟樣品解凍后, 用 4℃生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干后稱重,肝臟與勻漿介質(zhì)(pH 7.4)按1∶9 (w∶v)的比例冰浴勻漿, 制成10%勻漿液。勻漿液在4 ℃ , 4000 r/min離心10min, 上清液保存于–70℃冰箱。肝臟上清液蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定; 肝臟上清液超氧化物歧化酶(SOD)、抗超氧陰離子(ASAFR)和丙二醛(MDA), 分別采用黃嘌呤氧化酶法、黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法測定, 所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

肝臟三種熱休克蛋白 mRNA 表達水平的測定利用 p rimer premier5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物, 根據(jù)實驗室獲得的團頭魴HSP60全長序列設(shè)計特異性引物F1: 5′-TGCTGTCTACTGCTGAAGCCGTTGT -3′; R1: 5′-CCATCACTCAGTTTCGGCAGGTTT-3′。根據(jù)實驗室獲得的團頭魴 HSP70全長序列(GenBank Accession No.: FJ375325)設(shè)計HSP70特異性引物F2: 5′-CGACGCCAACGGAATCCTAAAT-3′; R2: 5′-CTTTGCTCAGTCTGCCCTTGT-3′。根據(jù)實驗室獲得的團頭魴HSP90全長序列設(shè)計特異性引物F3: 5′-TGCGGGACAACTCCACCAT-3′; R3: 5′-TC CAATGAGAACCCAGAGGAAAGC-3′。管家基因β-actin的引物是基于GenBank (GenBank Accession No.: AB037865)的序列設(shè)計: F4: 5′-TCTGCTATGTGGCTCTTGACTTCG-3′; R4: 5′-CCTCTGGGCACCT GAACCTCT-3′。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成, 擴增片段長度為123—152 bp。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及化學(xué)成分Tab. 1 Formulation and chemical composition of basal diet (% DM)

取每條團頭魴肝臟50—100 mg左右, 按照RNAiso Reagent (Takara有限公司)說明書提取總RNA, 一般A260/280為1.8—2.0。并以DNAase Ⅰ酶處理過的RNA以及RT液為模板, 用β-actin的定量引物分別進行PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示, 以RT液為模板有所需產(chǎn)物, 而以RNA為模板則無條帶(未列出), 說明處理過的RNA無DNA污染。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用SYBR ExScriptTMRT-PCR Kit (Takara公司)獲得單鏈cDNA。

HSP60、HSP70、HSP90 mRNA相對量采用SYBR ExScriptTMRT-PCR Kit (Takara公司), 利用 SYBR Green I嵌合熒光法進行Real Time PCR擴增反應(yīng)(ABI 7500熒光定量PCR, USA), 采用嵌合熒光法進行Real Time PCR擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為: Holding stage (50 ℃ 2min; 95 ℃ 3 min); Cycling stage (95 ℃ 15s; 60℃60s, 循環(huán)40次); Melt curve stage [95℃ 1 5s, 60 ℃ 60s (Date collection), 95 ℃ 3 0s, 60 ℃ 1 5s]。

隨機取樣品 cDNA, 設(shè)三個重復(fù), 獲得 HSP60的標(biāo)準(zhǔn)方程是y=–0.310x+10.65, 相關(guān)系數(shù)R2=0.991;獲得HSP70的標(biāo)準(zhǔn)方程是y=–0.361x+13.38, 相關(guān)系數(shù)R2=0.995; 獲得HSP90的標(biāo)準(zhǔn)方程是y= –0.314x+ 10.29, 相關(guān)系數(shù)R2=0.996; β-actin的標(biāo)準(zhǔn)方程是y=–0.304x+9.817, 相關(guān)系數(shù) R2=0.990; 其中 y代表起始模板濃度以10為底的對數(shù), x代表Ct值。

HSP60、HSP70、HSP90 mRNA水平計算以團頭魴β-actin為內(nèi)參, 對得到的各樣品Ct值進行均一化處理, 應(yīng)用各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法確定其相對水平[13]。

飼料中維生素 C的測定 每組飼料分別稱取0.5 g并粉碎, 每組5個重復(fù)。飼料與勻漿介質(zhì)(pH 7.4) 按1∶9 (w∶v)的比例冰浴勻漿, 然后4℃ 10000 r/min離心 20min, 取上清液用于分析?？箟难?維生素C)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所, 具體測定方法參照試劑盒說明書。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包中的單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan氏多重比較,檢驗各組間的差異, 不同的小寫字母表示各組之間比較差異顯著(P＜0.05)。所有的結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 維生素 C對團頭魴幼魚血清免疫相關(guān)指標(biāo)的影響

由表3可知, 隨著日糧中維生素C添加量的增加, 團頭魴幼魚血清中補體 C (C3)的濃度呈增加趨勢, 補體 4 (C4)的濃度呈先增加后降低趨勢; 其中,與對照組相比, 501.5 mg/kg試驗組血清C3濃度顯著增加了62.86%, 133.7 mg/kg試驗組血清C4濃度顯著增加了40.00% (P＜0.05)。在飼料中添加維生素C對血清堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)和皮質(zhì)醇(GOR)濃度均無顯著影響(P＞0.05), 但是TP、Alb含量略有增加趨勢, GOR含量略有降低趨勢。

表2 在日糧中添加不同水平的Vc 對團頭魴幼魚血清免疫指標(biāo)的影響Tab. 2 Effects of various levels of Vc on serum immunological indices of juvenile M. amblycephala

表3 在日糧中添加不同水平的Vc 對團頭魴幼魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響Tab. 3 Effects of various levels of Vc on liver antioxidant indices of juvenile M. amblycephala

2.2 維生素C對團頭魴幼魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表2可知, 隨著日糧中維生素C添加量的增加, 肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)活性和抗超氧陰離子(ASAFR)活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢, 其中,與對照組相比, 65.8、133.7和251.5 mg/kg試驗組SOD活性顯著提高了 28.01%、28.43%和 30.55% (P＜0.05); 33.4、65.8、133.7、251.5 mg/kg和501.5試驗組 ASA活性顯著提高了 48.99%、62.98%、69.09%、48.10%和41.33% (P＜0.05)。各組間肝臟中丙二醛(MDA)含量無顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 維生素C對團頭魴幼魚肝臟三種HSPs mRNA表達水平的影響

由圖1可知, 隨著日糧中維生素C添加量的增加, 3種肝臟HSPs基因表達水平均呈先增加后降低的趨勢, 其中HSP90基因表達最高, HSP60基因表達次之, HSP70 基因表達最低。與對照組相比, 133.7和251.5 mg/kg試驗組肝臟HSP60基因表達顯著增加了 520.54%、708.72%; 251.5 mg/kg試驗組肝臟HSP70基因表達顯著增加了814.59%; 251.5 mg/kg試驗組肝臟 HSP90基因表達顯著增加了 107.12% (P＜0.05)。

圖1 在飼料中Vc 添加量對團頭魴幼魚三種HSPs mRNA表達的影響Fig. 1 Effects of various levels of Vc on three HSPs mRNA expression levels in liver of juvenile M. amblycephala

2.4 維生素 C對團頭魴幼魚感染嗜水氣單胞菌后的保護作用

在攻毒試驗中, 團頭魴幼魚都不同程度地表現(xiàn)出由嗜水氣單胞菌引起的典型出血性敗血癥, 如腹部、鰭基部、鰓裂后部有充血或出血癥狀, 部分瀕死狀態(tài)的魚腹部膨大, 肛門紅腫, 解剖后發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)積水, 腸部充血發(fā)炎。

團頭魴幼魚人工注射感染嗜水氣單胞菌后, 維生素 C添加組魚的成活率在 12h、24h均顯著高于對照組(P＜0.05), 其中24h時, 0.2、33.4、65.8、133.7、251.5和501.5 mg/kg組的存活率依次為: 0、38.89%、38.89%、55.56%、61.66%和55.56%, 可以看出251.5 mg/kg試驗組效果最好(圖2)。

圖2 在飼料中Vc添加量對團頭魴幼魚感染嗜水氣單胞菌后成活率的影響Fig. 2 Effects of various levels of Vc on survival rate of juvenile M. amblycephala challenged with A. hydrophila

3 討論

3.1 維生素C對團頭魴幼魚血清免疫指標(biāo)的影響

魚類是較低等的脊椎動物, 體內(nèi)可能只存在lgM一種抗體, 且抗體形成期較長, 抗體滴度增高緩慢,它特異性免疫機制還很不完善[21]。因此, 非特異性免疫防御機制是魚類抵抗病原的第一道屏障, 在維持魚類機體健康和抗病原防御中具有更為重要的作用[22]。除了SOD等抗氧化指標(biāo)外, 血清中堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)和補體等也是重要的非特異性免疫指標(biāo), 被廣泛地用來評價魚類的健康狀況、營養(yǎng)狀況以及對環(huán)境的適應(yīng)狀況[23—25]。

其中, ALP是生物體內(nèi)的一種重要的代謝調(diào)控酶, 直接參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移和鈣磷代謝, 在魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用過程中發(fā)揮著重要作用;另外, ALP能夠通過改變病原體的表面結(jié)構(gòu)而增強被侵襲機體對病原體的識別和吞噬能力, 有助于提高魚的抗病力[26]。血清中 TP主要包括球蛋白(Glo)和白蛋白(Alb), TP具有維持血液正常膠體滲透壓,維持 pH恒定, 參與運輸脂肪酸等物質(zhì)和保護機體的作用, 也是間接地反映機體非特異性免疫水平的高低、衡量魚蝦類免疫健康與否的重要指標(biāo)[24,25]。在本試驗中: 日糧中維生素C的添加對團頭魴幼魚血清中ALP、TP和Alb的含量沒有顯著的影響, 這與Ren, et al.[26]結(jié)果不一致?？赡苁怯捎谠谟佐~期, ALP、TP和 Alb主要參與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用,具體關(guān)于其對團頭魴幼魚的作用機制還有待進一步研究。

研究表明, 在捕捉、驚嚇、擁擠、溫度和鹽度等的劇烈變化情況下, 血清中皮質(zhì)醇(COR)水平均有上升趨勢[27—29], 因而其常被看作是魚類應(yīng)激的靈敏信號[30]。在本實驗中維生素C未顯著影響團頭魴幼魚血清中COR的含量, 這可能是因為在長期慢性刺激過程中, 由于魚類已經(jīng)適應(yīng)了某些刺激,所以慢性脅迫對血清中COR水平并未產(chǎn)生顯著影響[31,32]。這與劉海燕等[33]報道表明飼料中添加維生素C對魚類在正常養(yǎng)殖過程中血清COR沒有顯著影響結(jié)果一致。

補體系統(tǒng)廣泛參與機體抗微生物防御反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié), 而補體3 (C3)、補體4 (C4)為補體系統(tǒng)中固有的成分, 是體內(nèi)一組具有酶原活性的球蛋白, 存在于體液中, 可通過免疫復(fù)合物、調(diào)理吞噬細胞等機制對機體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)等功能, 其水平是衡量體液免疫的重要指標(biāo)[34,35]。Li, et al.[36]、Hardie, et al.[37]、秦啟偉等[38]用維生素C分別投喂美洲沙鯰、大麻哈魚和青石斑魚, 均發(fā)現(xiàn)魚體血清中補體活性明顯提高。本實驗也表明: 與對照組相比, 試驗組C3、C4的濃度顯著增加了。這說明維生素C在一定程度上提高了血清C3、C4的濃度, 這有助于增強魚體的非特異性免疫力。本試驗同時發(fā)現(xiàn) C3、C4的濃度分別在不同維生素C添加量達到活力高峰, 這表明不同的免疫指標(biāo)對維生素 C添加量的反應(yīng)是不同的;此結(jié)果在Ortuno, et al.[3]對金頭鯛、Ai, et al.[8]對大黃魚的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)。

3.2 維生素 C對團頭魴幼魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

動物機體在新陳代謝過程中, 活性氧自由基的產(chǎn)生和消除保持著動態(tài)平衡。當(dāng)自由基的生成量超過了細胞的抗氧化消除能力時, 將會導(dǎo)致氧化脅迫[14],氧化機體的脂類、蛋白質(zhì)、酶和DNA, 最終造成機體損傷[15—17]。其中丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化物的主要成分, 具有很強的生物毒性, 會破壞細胞的結(jié)構(gòu)和功能; 超氧化物歧化酶(SOD)和抗超氧陰離子(ASAFR)等組成的抗氧化酶系統(tǒng)可清除過多的自由基, 對氧化脅迫的清除、增強吞噬細胞防御能力和機體免疫功能有重要作用[18]。其中SOD是最先與活性氧自由基作用的酶, 能清除超氧陰離子自由基,保護細胞免受損傷, 一直被認為是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶, 在機體自身防御系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中起重要作用[19]。因此, SOD、ASAFR和MDA可作為機體非特異性免疫指標(biāo), 來評判免疫激劑對機體非特異性免疫力的影響。在本試驗中各組間 MDA活性無顯著性差異。Zhou, et al.[19]、謝一榮等[20]分別比較了不同梯度維生素C對軍曹魚和大口黑鱸SOD活性的影響, 研究結(jié)果顯示血清中超氧化物歧化酶活性隨飼料維生素C含量的增加而顯著升高, 隨后有所降低, 表明飼料中添加一定量的維生素C能顯著提高超氧化物歧化酶活性, 但添加量應(yīng)該掌握在一定范圍內(nèi), 過量反而會抑制超氧化物歧化酶活性。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。各組間ASAFR活性與SOD活性的變化趨勢類似。這說明維生素C在魚體內(nèi)也能很好地發(fā)揮抗氧化作用, 維持自由基的產(chǎn)生與消除平衡, 保護機體免遭過氧化物的損傷。此外, 不同劑量的維生素C對團頭魴幼魚的SOD、ASAFR活性刺激作用間有差異, 這可能是不同劑量維生素C對其機體的抗氧化作用不同。

3.3 維生素C對團頭魴幼魚肝臟三種HSPs mRNA表達水平的影響

熱休克蛋白是魚類在環(huán)境脅迫下的應(yīng)激指標(biāo)[39],其中, 熱應(yīng)激蛋白60是一個分子伴侶, 每個亞基分子量約為 60 kD。在應(yīng)激條件下, HSP60在胞質(zhì)中HSP70作用下迅速從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到線粒體基質(zhì), 以修復(fù)線粒體基質(zhì)中的變性蛋白[40]; 熱應(yīng)激蛋白 70,能增加機體的自身保護反應(yīng), 可以清除應(yīng)激所造成細胞內(nèi)的異?；蜃冃缘鞍踪|(zhì)[41—44]; 熱應(yīng)激蛋白 90是平均分子量為 90 kD 的一類熱激蛋白, 在進化上高度保守, 廣泛參與了細胞周期和信號傳導(dǎo)等重要過程[45]。它們?yōu)榫S持細胞生存和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用。明建華等[46]報道表明了高劑量的維生素C能誘導(dǎo)提高魚體HSP70 mRNA 的基礎(chǔ)表達水平;韓喜彬等[47]發(fā)現(xiàn)在飲水中添加維生素C能使小鼠肝臟HSP70的表達趨于穩(wěn)定, 對熱應(yīng)激有一定的緩解作用。目前, 維生素C對魚類肝臟HSP60、HSP90 mRNA 表達的影響還未見報道。

本實驗也表明團頭魴幼魚肝臟中 HSP60、HSP70、HSP90的基因表達模式是都是隨著日糧中維生素 C添加量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在 240 mg/kg試驗組達最大值, 與對照組相比, 120和240 mg/kg試驗組顯著增加了肝臟HSP60基因表達; 240 mg/kg試驗組顯著增加了肝臟HSP70基因表達。這說明在一定維生素C添加范圍內(nèi), 維生素 C能夠顯著提高肝臟中 HSP60、HSP70、HSP90基因基礎(chǔ)表達水平, 從而增強對機體的保護作用[48,49]。這與以上報道也是基本一致的。本試驗同時發(fā)現(xiàn), HSP90基因表達最高, HSP60基因表達次之, HSP70基因表達最低; 但是各組間HSP70基因表達變化是最大的, 這是因為本試驗中 HSP70屬于誘導(dǎo)型HSP70, 通常在正常細胞中并不表達或表達量很少,但是在熱應(yīng)激或其他應(yīng)激原的作用下, 則表達迅速增加[49]。正是由于HSP70這種 “全或無”的表達特點,所以它是HSP中研究最多的一個家族[50]。

3.4 維生素 C對團頭魴幼魚感染嗜水氣單胞菌后的保護作用

動物的成活率是其疾病抵抗力高低的綜合反映指標(biāo), 尤其是攻毒后的成活率可以綜合反映水生動物的免疫能力[51]。本實驗結(jié)果表明, 團頭魴感染嗜水氣單胞菌后不同程度地表現(xiàn)出典型的出血癥狀,這與徐磊等[52]的報道是一致的。本研究發(fā)現(xiàn), 各維生素C 試驗組比對照組較遲出現(xiàn)以上病癥; 攻毒試驗也表明, 各維生素C試驗組的成活率在12h、24h均顯著高于對照組(P＜0.05), 這說明維生素 C可在一定程度上降低嗜水氣單胞菌的危害。在其他的魚種上也有類似的報道, 如文華等[53]報道飼料中添加高水平維生素C能顯著提高草魚感染嗜水氣單胞菌后的成活率; Navarre, et al.[54]的研究也表明, 在每千克飼料中添加500 mg的維生素C能顯著增加虹鱒感染鰻弧菌(注射或浸泡)后的成活率。同時由于大多數(shù)魚類特異性抗體的產(chǎn)生需要長期的適應(yīng)并通過產(chǎn)生記憶而形成[55], 因此本試驗中添加維生素 C組團頭魴幼魚成活率的提高, 可能與前文所述, 維生素C提高了機體超氧化物歧化酶、補體C、補體4的活性以及熱應(yīng)激蛋白的表達有關(guān)。

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EFFECTS OF DIETARY VITAMIN C ON THE NON-SPECIFIC IMMUNITY, THREE HSPs mRNA EXPRESSION AND DISEASE RESISTANCE OF JUVENILE WUCHANG BREAM (MEGALOBRAMA AMBLYCEPHALA)

WAN Jin-Juan1,2, LIU Bo1,2, GE Xian-Ping1,2, XIE Jun1,2, CUI Su-Li1,2and ZHOU Ming2,3
(1. Wuxi Fisheries College, Nanjing Agricultural University, Wuxi 214081, China; 2. Key Laboratory of Genetic Breeding and Aquaculture Biology of Freshwater Fishes, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China; 3. Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

A 90-day feeding trial was conducted to determine the effects of vitamin C on the non-specific immunity, three HSPs mRNA expression and disease resistance of juvenile Wuchang bream (Megalobrama amblycephala) [initial mean body weight of (6.40±0.05) g]. The fish was selected and randomly divided into six groups and Vc supplemented at 0.2, 33.4, 65.8, 133.7, 251.5 and 501.5 mg/kg diet, respectively. The fish was fed for 90 day. Compared with the control, the contents of serum C3 of the 501.5 mg/kg Vc group were increased, the contents of serum C4 of the 133.7 mg/kg Vc group were improved; the hepatic SOD activities of 65.8—251.5 mg/kg Vc groups were enhanced and the hepatic ASAFR activities of all treated groups were enhanced; the expression level of HSP60 mRNA of 133.7 and 251.5 mg/kg Vc groups were improved, the expression levels of HSP70 and HSP90 mNA of 251.5 mg/kg Vc group were significantly improved (P＜0.05); the survival rates in all treated groups were significantly higher than that of the control at 12 h and 24 h after injecting Aeromonas hydrophila (P＜0.05), and the survival rate of the 251.5 mg/kg Vc group was the highest. Other indices, such as total protein, albumin, serum cortisol and MDA were not significantly different from the control (P＞0.05). Therefore, the basal diet supplemented with 133.7—251.5 mg/kg doses of Vc could improve the immunity of juvenile Wuchang bream effectively.

Wuchang bream (Megalobrama amblycephala); Vitamin C; Non-specific immunity; Three HSPs mRNA expression; Disease resistance

S963

A

1000-3207(2014)01-0010-09

10.7541/2014.02

2012-09-07;

2013-06-12

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-46); 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費(201003020); 中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(2012A0602)資助

萬金娟(1989—), 女, 安徽省宣城人; 碩士研究生; 研究方向為水產(chǎn)動物營養(yǎng)與免疫。E-mail: wanjinjuan.a@163.com

戈賢平, 研究員, 博士生導(dǎo)師; E-mail: gexp@ffrc.cn