衣原體最新分類體系與分類鑒定方法研究進(jìn)展

李 鵬(綜述)，端 青，宋立華(審校)

衣原體是一類專性真核細(xì)胞內(nèi)寄生、具有獨(dú)特發(fā)育周期、可以在多種真核生物宿主(包括人、動(dòng)物、原蟲等)中繁殖的細(xì)菌。這類菌的共同特征是：(1)革蘭染色陰性；(2)有核糖體和細(xì)胞壁；(3)有獨(dú)特的發(fā)育周期，有感染能力的始體(EB)首先在胞漿囊泡內(nèi)分化成有繁殖能力的網(wǎng)狀體(RB)，RB以二分裂方式繁殖，在發(fā)育周期的中后期RB重新分化為EB；(4)含有DNA和RNA兩類核酸。衣原體感染宿主廣泛，可以引起人與動(dòng)物多種疾病，感染人可導(dǎo)致沙眼、肺炎、泌尿系統(tǒng)疾病等，感染動(dòng)物如家禽、家畜可導(dǎo)致嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1]。本文綜述了衣原體分類的新進(jìn)展與衣原體的生物學(xué)與分子生物學(xué)分類特征，對(duì)衣原體分類鑒定、流行病學(xué)調(diào)查等具有指導(dǎo)意義。

1 衣原體最新分類體系

衣原體按照細(xì)菌分類學(xué)，界、門、綱、目、科、屬、種進(jìn)行具體劃分。最新的第2版《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)依據(jù)16S rRNA基因的同源性將衣原體歸為獨(dú)立的衣原體門(Chlamydiae)[2]。衣原體門包括一個(gè)衣原體綱(Chlamydiia)，一個(gè)衣原體目(Chlamydiales)，衣原體目下設(shè)8個(gè)科、11個(gè)屬。其中與人或動(dòng)物衣原體病相關(guān)的衣原體主要?dú)w類到衣原體科(Chlamydiaceae)，該科有一個(gè)衣原體屬(Chlamydia)，包含12個(gè)衣原體種：沙眼衣原體(C.trachomatis)、鼠衣原體(C.muridarum)、豬衣原體(C.suis)、肺炎衣原體(C.pueumoniae)、鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)、流產(chǎn)衣原體(C.abortus)、家畜衣原體(C.pecorum)、豚鼠衣原體(C.caviae)、貓衣原體(C.felis)、朱鷺衣原體(C.ibidis)[3]、鳥衣原體(C.avium)和家禽衣原體(C.gallinacea)[4]。其中朱鷺衣原體、鳥衣原體和家禽衣原體是新發(fā)現(xiàn)的衣原體種(詳介見下面)。圖1顯示了衣原體科內(nèi)各代表種與其它科代表菌株的16S rRNA進(jìn)化地位。

上一次衣原體分類體系的變革發(fā)生在1999年，美國學(xué)者Everett等以16/23S rRNA序列相似度為依據(jù)，提出了建立嗜衣原體屬(Chlamydophila)和多個(gè)新種如豬衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體、豚鼠嗜衣原體和貓嗜衣原體等[5]。在這個(gè)舊的分類體系中，新劃出的幾個(gè)衣原體新種得到了認(rèn)可，但關(guān)于嗜衣原體屬的提議遭到了多數(shù)衣原體學(xué)家的反對(duì)。該屬當(dāng)時(shí)只有一個(gè)種水平上的鑒定依據(jù)—rRNA序列同源性大于95%，這個(gè)分類依據(jù)遭到了質(zhì)疑，原因概括有：①16S rRNA雖被稱為細(xì)菌進(jìn)化的化石，但分類學(xué)家已發(fā)現(xiàn)16S rRNA序列分析不適用于所有細(xì)菌種的鑒定；②沒有傳統(tǒng)上易接受的生物學(xué)分類標(biāo)記，成立嗜衣原體屬的必要性不充分；③僅有的rRNA分類依據(jù)在屬分類上已造成了混亂，如鼠衣原體與豚鼠嗜衣原體屬于兩個(gè)屬但它們的16S rRNA同源性性卻大于95%[6]。國際衣原體分類委員會(huì)于2009年取消了嗜衣原體屬的說法[7-8]。第2版《伯杰細(xì)菌學(xué)系統(tǒng)手冊(cè)》也依據(jù)命名穩(wěn)定、避免混淆的原則只保留了“衣原體屬”的命名。事實(shí)上嗜衣原體屬的提議一直沒有得到統(tǒng)一應(yīng)用，最新的衣原體分類體系在實(shí)際應(yīng)用中具有更鮮明的指導(dǎo)意義[9]。

2 新發(fā)3種衣原體—朱鷺衣原體、鳥衣原體和家禽衣原體

Vorimore等在2013年報(bào)道了在法國西部的野生鳥—埃及圣鹮(feral sacred ibis)上分離到一個(gè)新衣原體種—朱鷺衣原體(Chlamydiaibidis)[3]；埃及圣鹮的學(xué)名為Threskiornisaethiopicus，屬于鹮屬，朱鷺科；Ibidis是ibis(朱鷺)的所有格，我們因此將Chlamydiaibidis翻譯為朱鷺衣原體，有兩個(gè)分離株10-1398/6和10-1389/1，其中10-1398/6為模式株。

Fig.1 Total length sequence of 16S rRNA phylogenetic tree of representative strains in Chlamydiales

Konrad等通過分析鴿子、鸚鵡、家禽中的未歸類衣原體分離株，提出命名兩個(gè)新種—鳥衣原體(Chlamydiaavium)和家禽衣原體(Chlamydiagallinacea)[4]，二者的模式菌株分別是10DC88，08-1274/3。目前已知的鳥衣原體菌株來源于鴿子和鸚鵡，而家禽衣原體菌株則分離自肉雞、珍珠雞、火雞及其它家禽。

以上3種新發(fā)衣原體均可以從鳥類的泄殖腔和糞便中分離到，在電鏡下有典型的RB與EB，可以用接種雞胚卵黃囊法或細(xì)胞法培養(yǎng)，但它們的致病性還不明確。多數(shù)動(dòng)物衣原體的宿主存在多樣性，它們很有可能會(huì)感染其它的鳥類或動(dòng)物，甚至人。衣原體的種類和宿主范圍都在擴(kuò)展，生物多樣性在衣原體學(xué)科上初步開始展現(xiàn)，可能還有較多的未知衣原體有待發(fā)現(xiàn)，有待于衣原體專業(yè)工作者去研究。

3 衣原體分類鑒定方法

衣原體的分類鑒定依據(jù)經(jīng)歷了從傳統(tǒng)方法(形態(tài)結(jié)構(gòu)、生化特征、抗原結(jié)構(gòu)、血清學(xué)方法等)到近年來越來越倚重分子遺傳學(xué)方法的發(fā)展過程。1956年我國學(xué)者湯飛凡等首次報(bào)道了在沙眼患者病料中分離到沙眼病毒，這是衣原體研究史上的一個(gè)里程碑進(jìn)展[10]。在分離到沙眼病原后，1957年衣原體根據(jù)宿主的不同被分為兩個(gè)種：感染動(dòng)物的鸚鵡熱衣原體、與感染人眼部或生殖道系統(tǒng)的沙眼衣原體，詳見《第八版伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Eight Edition)。近60年過去了，如前所述，衣原體的分類系統(tǒng)已發(fā)生了巨大變化。每一個(gè)新科、新種的定義都是分析衣原體分類學(xué)研究的例子。目前的衣原體的分類鑒定依據(jù)是傳統(tǒng)分類方法與分子遺傳學(xué)方法的融合，一個(gè)很好的例子就是新發(fā)現(xiàn)的朱鷺衣原體的分類與鑒定。

3.1傳統(tǒng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)分析與血清學(xué)方法仍是衣原體分類鑒定重要依據(jù) 傳統(tǒng)的衣原體分類鑒定依據(jù)主要有形態(tài)結(jié)構(gòu)、糖原的積累、磺胺嘧啶敏感性、血清學(xué)方法等?；谝略w的描述性定義可以看出，在生物表型上目前已知的衣原體均有獨(dú)特的發(fā)育周期，也即具有EB與RB兩種結(jié)構(gòu)形式，因此通過電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析是衣原體鑒定的第1步，特別是新發(fā)現(xiàn)衣原體的分類鑒定。電鏡不是微生物分類的常用工具，但可直接提供衣原體的形態(tài)、原核本質(zhì)、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)等，是研究或分類衣原體的重要工具。早前，生物學(xué)特征如糖原染色特性與磺胺嘧啶敏感性，曾用于沙眼與鸚鵡熱衣原體種的鑒別[2]。表1概括了衣原體屬內(nèi)10個(gè)種的基本生物學(xué)特征，可以看出隨著衣原體種類的增加，傳統(tǒng)的有限的生物學(xué)特征已不能適應(yīng)衣原體分類的需要。事實(shí)上現(xiàn)在已知，由于衣原體不能進(jìn)行胞外繁殖、不同的衣原體專業(yè)實(shí)驗(yàn)室有自己傳統(tǒng)的研究平臺(tái)，個(gè)別表型如糖原染色性質(zhì)等在不同的實(shí)驗(yàn)體系上可能存在較大差異。在體外研究模型中，有限的、還可能是不穩(wěn)定的衣原體理化性質(zhì)分類依據(jù)已成為歷史。

血清學(xué)方法常用于衣原體的詳細(xì)分類，特別是常見衣原體種如沙眼衣原體與鸚鵡熱衣原體的血清學(xué)分型。目前沙眼衣原體有15個(gè)血清型，分別為A，B，Ba，C-K，L1，L2，L3，其中A-C為眼睛生物型，D-K為生殖生物型，L1-L3為LGV生物型[2]；鸚鵡熱衣原體有9個(gè)血清型，分別為A-F，E/B，M56與WC。衣原體的血清型特異性抗原決定簇均位于ompA編碼的主要外膜蛋白(MOMP)，在實(shí)際應(yīng)用中血清分型已被ompA基因分型代替[11]。MOMP是衣原體外膜的主要組成部分，是衣原體的黏附素之一，是重要的衣原體中和保護(hù)性抗原。以上眾多的血清型表明MOMP有可能在衣原體的免疫逃避中發(fā)揮作用，這對(duì)研制具有泛保護(hù)活性的衣原體疫苗具有指導(dǎo)意義[12-13]。雖然ompA基因分型已普遍應(yīng)用，但在鑒定新的ompA基因型時(shí)仍需要使用血清學(xué)方法(中和實(shí)驗(yàn)或免疫熒光)進(jìn)行驗(yàn)證。值得一提的是，ompA被認(rèn)為是衣原體發(fā)生變異或重組的活躍基因，但目前臨床上還沒有發(fā)現(xiàn)新的ompA基因型，未來大范圍的ompA流行病學(xué)調(diào)查將有助于理解ompA的變異性或保守性及其在衣原體進(jìn)化中的作用。

Tab.1 Basic biological characteristics of 12 species in Chlamydia

3.2分子遺傳學(xué)方法是目前衣原體分類鑒定的常用方法和標(biāo)準(zhǔn)方法 目前衣原體分類鑒定的分子遺傳學(xué)依據(jù)主要有16S rRNA序列分析、ompA序列分析(也用于基因分型)、特異性基因分析和級(jí)聯(lián)基因序列分析等。①由于16S rRNA基因的高度保守性和種屬差異性，其是目前細(xì)菌學(xué)分類鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，Everett等提出的在科屬水平上分類衣原體的16S rRNA同源性閾值已被認(rèn)可。第二版《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》依據(jù)16S rRNA基因全長序列的同源性成立了衣原體門，衣原體門內(nèi)16S rRNA相似性>80%，衣原體目內(nèi)不同科間的16S rRNA相似性為80%～90%，同一科不同屬間的16S rRNA相似性>90%，各屬內(nèi)部的16S rRNA序列相似性>95%，株與株之間16S rRNA序列相似性>99%時(shí)認(rèn)為它們是同一種中的不同株[2]。②除了16S rRNA，ompA序列分析常用于衣原體種的鑒定與基因分型。③特異性基因分析是衣原體分類鑒定的一個(gè)方法，可參考Griffiths等在Everett的分類系統(tǒng)基礎(chǔ)上對(duì)衣原體蛋白質(zhì)組進(jìn)行的BLAST分析結(jié)果。作者共篩選出了59個(gè)衣原體門特異蛋白、79個(gè)衣原體科特異蛋白、衣原體屬和嗜衣原體屬特異蛋白各20個(gè)[14]。④級(jí)聯(lián)基因序列分析是理解衣原體親緣性和進(jìn)化關(guān)系的一個(gè)補(bǔ)充方法。Richard等將110個(gè)衣原體保守基因串聯(lián)后進(jìn)行種系發(fā)育分析[6]，結(jié)論與16S rRNA系統(tǒng)發(fā)生樹有所不同，體現(xiàn)了這個(gè)方法的價(jià)值。在對(duì)發(fā)現(xiàn)朱鷺衣原體的文章中，Vorimore等對(duì)16S rRNA、ompA、及31個(gè)保守基因級(jí)聯(lián)后進(jìn)行了序列比較分析，確認(rèn)了其為衣原體科的一個(gè)新物種。

3.3全基因組分析是分類鑒定新發(fā)現(xiàn)衣原體的必要方法 隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，微生物基因組學(xué)已進(jìn)入了大數(shù)據(jù)時(shí)代，基因組序列現(xiàn)已成為報(bào)告新發(fā)現(xiàn)微生物的必需數(shù)據(jù)，如發(fā)現(xiàn)朱鷺衣原體的文章同時(shí)發(fā)表了代表株的全基因組序列。將全基因組引入細(xì)菌的分類鑒定具有積極的意義。與傳統(tǒng)分類依據(jù)相比，基因組為微生物分類鑒定提供了更加豐富的分類依據(jù)，更能相對(duì)準(zhǔn)確地體現(xiàn)微生物的自然進(jìn)化史。分類學(xué)家利用了全基因組序列中更多的分類特性來確定種屬相似度，如基因的排列順序、核心基因的分析(基因的存在、缺失或序列比對(duì))、核心基因中單核苷酸的多態(tài)性、種系發(fā)育樹構(gòu)建、同源基因的平均核酸序列一致性(AverageNucleotideIdentity, 簡寫為ANI)等。在全基因組測(cè)序使用中，一般認(rèn)為ANI值>96%則兩株細(xì)菌屬于同一個(gè)種，這一數(shù)據(jù)的應(yīng)用在16S rRNA序列相似性>98.7%時(shí)顯得尤為重要[15]。

目前使用基因組進(jìn)行系統(tǒng)分類還有局限性[16]，①微生物主要譜系的全基因測(cè)序數(shù)據(jù)還很缺乏；②即使有全基因組數(shù)據(jù)可以利用，但其并不是典型菌株，其可靠性還有待商榷；③由于測(cè)序手段和技術(shù)的差異使得已經(jīng)完成的全基因組數(shù)據(jù)存在很大差別，需要對(duì)最小測(cè)序質(zhì)量提出一個(gè)定義，來解決全基因組測(cè)序的差異性；④衣原體為專性胞內(nèi)寄生，培養(yǎng)和純化的技術(shù)要求高，加上全基因組分析需要專業(yè)的生物信息學(xué)支持，故目前只有少數(shù)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室具備衣原體全基因組分析能力；⑤基因組學(xué)雖然極大促進(jìn)了進(jìn)化與分類學(xué)研究，但應(yīng)當(dāng)看到我們對(duì)微生物進(jìn)化的理解還很有限，還需要從基因功能的方向繼續(xù)深入研究。盡管有以上局限性，由于衣原體專性在囊泡內(nèi)繁殖、其接觸外源基因的幾率低、其基因組被認(rèn)為高度保守，全基因組分析在衣原體分類上的應(yīng)用有特殊的優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié) 語

衣原體是一大類與人關(guān)系密切的微生物，其分類體系對(duì)教學(xué)、科研等均有直接的指導(dǎo)意義。最新衣原體分類體系的最大變化是取消了嗜衣原體屬，3種新發(fā)衣原體使衣原體屬進(jìn)一步擴(kuò)展到了12個(gè)種。除了3種新發(fā)衣原體，這個(gè)分類方法已得到國外衣原體學(xué)家的認(rèn)可，我國也有必要在今后使用這個(gè)分類系統(tǒng)。目前衣原體分類鑒定的常用方法主要有16S rRNA、ompA及其它特異性基因序列分析，級(jí)聯(lián)基因序列分析；形態(tài)結(jié)構(gòu)和血清學(xué)特征是定義、分型衣原體的重要依據(jù)；全基因組測(cè)序?yàn)榉诸愯b定新發(fā)現(xiàn)衣原體提供了強(qiáng)有力的工具。無疑，衣原體的分類體系與方法仍在快速發(fā)展中，特別是新發(fā)現(xiàn)衣原體種的快速增加，如2013年8月PLoS ONE雜志報(bào)道的重要魚類衣原體病原體CandidatusSyngnamydia venezi[17]。隨著更多新發(fā)現(xiàn)衣原體種的分類鑒定和分類方法的發(fā)展，衣原體分類系統(tǒng)將更臻合理完善。

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