水稻強弱勢粒24-nt siRNA表達量與DNA甲基化的關系研究

劉燕霞， 彭 廷， 趙亞帆， 杜彥修， 張 靜， 李俊周， 趙全志， 孫紅正

(河南農業(yè)大學農學院，河南 鄭州 450002)

DNA甲基化是表觀遺傳學的一種重要形式，在維護基因組穩(wěn)定性、調節(jié)基因表達、調控植物發(fā)育等方面具有重要作用[1～3].24-nt siRNA是植物中數量最多的小RNA，能在基因轉錄后水平或轉錄水平分別通過切割靶基因和介導DNA甲基化來調控基因表達，從而調節(jié)植物的生長調節(jié).目前，多數研究認為，24-nt siRNA主要參與RNA介導的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation，RdDM)[4～6]，因此,研究24-nt siRNA表達量與DNA甲基化之間的關系，對基因表達差異形成的原因探討具有重要的指導作用.MORITOH等[2]通過研究水稻中參與DNA甲基化的甲基化酶OSDRM2突變體，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化水平降低，且參與指導DNA甲基化的siRNA(small interfering RNA，siRNA)表達量也有所降低.GROSZMANN等[7]認為,24-nt siRNA水平降低與DNA甲基化和基因表達變化有關，并對雜種優(yōu)勢有作用.通過對大穗型水稻品種新豐2號灌漿過程中5個時期的小RNA進行測序，發(fā)現(xiàn)隨著灌漿的持續(xù)，強弱勢粒中24-nt siRNA的表達量逐漸降低，而且在各個時期弱勢粒中24-nt siRNA的表達量都高于強勢粒[8].目前,關于水稻子粒灌漿過程中強弱勢粒間有差異表達的24-nt siRNA能否引起靶基因甲基化差異的研究未見報道.為了探討強弱勢粒24nt-siRNA表達量與靶基因DNA甲基化之間的關系，本研究采用亞硫酸鹽測序法檢測了強弱勢粒中產生大量24-nt siRNAs的靶基因甲基化狀態(tài)，分析DNA甲基化差異，并對強弱勢粒24-nt siRNA與DNA甲基化之間的關系進行討論.

1 材料與方法

1.1材料

以黃淮流域大面積推廣的大穗型粳稻新豐2號為材料，2012-06-18種植于河南農業(yè)大學科教園區(qū).抽穗開花期選取生長整齊，株型一致，同1 d開花的主穗掛牌標記.取花后10 d的小穗，按PENG等[9]的方法分離強弱勢粒，液氮速凍后，于-80 ℃保存.

1.2方法

1.2.1 水稻強弱勢粒24-nt siRNA實時熒光定量PCR驗證 按microRNA實時定量莖環(huán)RT-PCR原理[10]，設計3對24-nt siRNA引物(表1).新豐2號花后10 d強弱勢?？俁NA的提取用RNA提取試劑盒(TransGen Biotech，Tranzol Plant,ET1201-01)進行，然后使用HiFi-MMLV cDNA Kit(康為世紀，CW0744A)反轉錄成cDNA. 取5 μL按1∶20稀釋的cDNA做模板，配置20 μL含有10 μL UltraSYBR mixture反應體系，以β-actin為內參基因，在BioRad Iq5儀器上進行實時熒光定量PCR，反應程序：95 ℃預保溫10 min ，95 ℃變性30 s ，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán).所有PCR均設置3次重復，24-nt siRNA相對表達量用2-△△Ct方法計算[11].

表1 實時熒光定量qRT-PCR和DNA甲基化檢測引物序列

1.2.2 亞硫酸鹽測序法檢測DNA甲基化狀態(tài) 水稻子粒基因組DNA提取使用基因組提取試劑盒(康為世紀，CW2298)，提取的基因組DNA用甲基化DNA檢測試劑盒(康為世紀，CW2140)進行重亞硫酸氫鹽處理[12，13].以甲基化處理后的DNA做模板，分別用引物BSP-1F/BSP-1R和BSP-2F/BSP-2R進行巢式PCR擴增，引物序列見表1.反應結束后用質量分數1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，采用DNA產物純化試劑盒(康為世紀，CW0520)回收PCR產物.回收的PCR產物分別進行TA克隆，轉化感受態(tài)細胞DH5α，隨機挑取15個克隆進行測序.

1.2.3 CyMATE在線軟件分析DNA甲基化水平 植物DNA甲基化有3類：對稱性CG,CHG和非對稱CHH(H表示A，T或C)[2].采用HETZL等[14]提出的CyMATE在線軟件(http://www.cymate.org/)分析法分別得到每個克隆的3類胞嘧啶甲基化水平，每個克隆總胞嘧啶甲基化比例為每個克隆3類胞嘧啶甲基化比例之和.以1個克隆作為1次重復，用Excel軟件統(tǒng)計靶基因區(qū)域胞嘧啶整體甲基化水平(總胞嘧啶甲基化比例)和3類胞嘧啶甲基化水平.

2 結果與分析

2.1水稻強弱勢粒24-ntsiRNA實時熒光定量驗證

大規(guī)模小RNA測序數據結果表明，新豐2號基因組第12條染色體的1個DNA區(qū)段產生大量24-nt siRNA (圖1).從中選取3個高表達的24-nt siRNA(siR138309，siR326225，siR95400)，用qRT-PCR方法檢測花后10 d在強弱勢粒中的表達水平.結果顯示,3個24-nt siRNA的相對表達量在強弱勢粒間存在差異，且在弱勢粒中的表達量都高于強勢粒，與測序結果一致(圖2).

2.2水稻24-ntsiRNA靶基因甲基化狀態(tài)及差異分析

選定的24-nt siRNA靶基因區(qū)段核苷酸長度為330 bp，以重亞硫酸氫鹽后的水稻強弱勢粒基因組DNA為模板，采用巢式PCR方法均擴增出330 bp的條帶，與預期結果一致.通過克隆測序檢測強弱勢粒中24-nt siRNA靶基因區(qū)段胞嘧啶甲基化狀態(tài)，用CyMATE在線軟件輸出靶基因甲基化狀態(tài)(圖3).

圖1 10個表達量高的24-nt siRNAs在第1外顯子上的分布

圖中黑色長方框為第1外顯子，方框左右的短線分別代表非編碼區(qū)和內含子區(qū).siR138309等10個siRNAs是10個表達量高的24-nt siRNAs. siR138309下方黑色短方框在黑色長方框上對應的位置代表siR138309靶基因在第1外顯子上的分布.

The long black box in the figure represents the first exon region and the single line on the left and right sides of the long black box represents non-coding region and intron region respectively. Ten siRNAs for example siR138309 are ten high expression 24-nt siRNAs. The position of black long box opposited to the short black box below siR138309, show the distribution of siR138309 target genes on the fist exon region.

圖2 24-nt siRNAs大規(guī)模測序豐度(A)和24-nt siRNAs實時熒光定量qRT-PCR驗證(B)

圖3 水稻強弱勢粒DNA甲基化示意圖

實心圖表示胞嘧啶發(fā)生甲基化;空心圖則表示胞嘧啶未發(fā)生甲基化;圓形為CG二核苷酸;方形為CNG三核苷酸;三角形為CHH三核苷酸.S為強勢粒，共有11個克隆;I為弱勢粒，共14個克隆.圖中position對應的數字表示目標片段中胞嘧啶所在的位置.

The filled symbols represent cytosine methylation and empty symbols represent unmethylated cytosine. The circles indicate CG, squares for CHG and triangles for CHH. S represent superior grains, and S-1—S-11 represent 11 clones sequenced. I is for inferior grains, and I-1—I-14 for 14 clones sequenced. The numbers at the bottom of the figure indicates the nucleotide position of the cytosine methylation along the sequence alignment.

本試驗中亞硫酸鹽測序檢測的24-nt siRNA靶基因為LOC_Os12g40000的第1個外顯子(209 bp)，共含有80個胞嘧啶，其中CG類型的胞嘧啶25個，占總胞嘧啶的31.25%，CNG類型的胞嘧啶21個，占總胞嘧啶的26.25%，而CHH類型的胞嘧啶有34個，占總胞嘧啶的42.50%.靶基因總胞嘧啶甲基化水平在強弱勢粒間存在顯著差異(P<0.05)，強勢?？偘奏ぜ谆娇蛇_到82.84%，弱勢粒只有64.02%，強勢粒靶基因甲基化水平高于弱勢粒.CG類二核苷酸胞嘧啶甲基化水平在強弱勢粒間雖然都高達98%，但沒有差異.組成總胞嘧啶的2類CHG和CHH三核苷酸胞嘧啶甲基化水平在強勢粒中均高于弱勢粒，且CHH差異顯著(P<0.05)(圖4).由于CHG和CHH類胞嘧啶占靶基因總胞嘧啶的72.5%，由此推測，強弱勢粒間CHG和CHH類甲基化差異可能是造成強弱勢粒靶基因甲基化水平差異的主要原因.

3 結論與討論

水稻基因組中大多數CG群與基因有關，而基因與基因之間的甲基化水平差異很小[15].作者檢測到了水稻花后10 d種子發(fā)育中CG，CHG和CHH的3類DNA甲基化狀態(tài).對強弱勢粒間3類DNA甲基化水平分析發(fā)現(xiàn)，強弱勢粒中CG類甲基化水平都高但不存在差異，而強勢粒中CHG和CHH類甲基化水平都高于弱勢粒，最終導致強勢粒整體甲基化水平高于弱勢粒.因此，水稻強弱勢粒間高程度的CG甲基化可能是基因存在的標志，而強弱勢粒間CHG和CHH甲基化差異可能是在種子發(fā)育過程中形成的.

圖4 水稻強弱勢粒間靶基因總胞嘧啶甲基化水平及3類胞嘧啶甲基化水平

24-nt siRNAs能夠通過RdDM途徑指導序列特異性DNA甲基化和組蛋白修飾[16].通過對新豐2號花后5個時期的測序發(fā)現(xiàn)，24-nt siRNA在弱勢粒的每個時期的表達量都非常高[8].根據目前的研究認為，相對于強勢粒，弱勢粒中表達量較高的24-nt siRNA將會導致較高水平的DNA甲基化[3～5].本試驗選取了產生大量24-nt siRNAs的DNA片段，對其胞嘧啶甲基化水平進行亞硫酸鹽測序分析，結果表明，強勢粒中表達量較低的24-nt siRNA，其靶基因甲基化水平比弱勢粒高.

出現(xiàn)這種情況的一個可能原因是強弱勢粒間24-nt siRNA的差異是DNA甲基化造成的.有證據表明，轉錄起始位點下游的DNA甲基化，特別是第1個外顯子的甲基化會導致基因轉錄水平的沉默[17].24-nt siRNA的產生首先需要pol IV轉錄出單鏈RNA，單鏈RNA在RDR2作用下合成互補鏈形成雙鏈RNA，最后雙鏈RNA由DCL3切割成為24-nt siRNA[18～21].轉錄水平的沉默會造成24-nt siRNA產生源頭減少，最終導致24-nt siRNA表達量降低.本試驗研究的24-nt siRNA靶基因區(qū)域為第1外顯子，強勢粒第1外顯子較高的甲基化水平，可能導致了基因轉錄的高度抑制，進而引起強勢粒產生較少的24-nt siRNA弱勢粒，反之亦然.因此，弱勢粒24-nt siRNA表達量高可能是甲基化水平低造成的結果.

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