郭 麗, 郭程瑾, 路文靜, 李小娟, 肖 凱*
(1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 河北保定 071001; 2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定 071001)
磷易被吸附、 固定的特性導(dǎo)致作物對(duì)磷素資源的利用效率較低[1]。磷素作為不可再生資源,世界范圍內(nèi)用于生產(chǎn)磷肥的磷礦石資源日益枯竭[2]。利用植物在吸收和利用磷素資源上表現(xiàn)的遺傳多樣性特征,提高作物抵御低磷逆境能力,對(duì)于促進(jìn)磷素資源的可持續(xù)利用具有重要實(shí)踐意義。
研究表明,作物根系存在兩個(gè)磷素吸收運(yùn)載系統(tǒng),其中一個(gè)系統(tǒng)對(duì)介質(zhì)中磷素具有高親和特性(Km值變化在3至7 μmol/L),主要參與對(duì)低濃度無(wú)機(jī)磷(Pi)供應(yīng)水平下介質(zhì)中的磷素吸收[1]; 另一個(gè)系統(tǒng)對(duì)介質(zhì)中磷素具有低親和特性(Km變化在50至330 μmol/L),主要參與高濃度Pi供應(yīng)水平下介質(zhì)中的磷素吸收以及植株中Pi在細(xì)胞、 組織間的轉(zhuǎn)運(yùn)[2-3]。研究證實(shí),位于根系表皮和根毛細(xì)胞質(zhì)膜上的高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PT)和位于植株中各器官、 組織細(xì)胞質(zhì)膜的PT,分別是上述高、 低親和磷素吸收運(yùn)載系統(tǒng)的重要組分[1,3 ]。迄今,在擬南芥和水稻等不同植物種屬中已鑒定了許多PT基因,并對(duì)上述基因分子特征及介導(dǎo)磷素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的生物學(xué)功能及其機(jī)理進(jìn)行了深入研究[4-8]。
小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要糧食作物,提高小麥的磷素利用效率對(duì)于保障我國(guó)糧食安全和促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要現(xiàn)實(shí)意義。迄今,盡管有關(guān)小麥磷素吸收、 利用的遺傳學(xué)差異、 生理生化機(jī)制和小麥基因型(品種)的磷效率鑒定評(píng)價(jià)指標(biāo)已開(kāi)展較多研究[9-11],但有關(guān)小麥PT基因的鑒定、 分子特征分析和功能解析研究與擬南芥和水稻相比仍較少。前期工作中,作者對(duì)1個(gè)歸屬于高親和家族的小麥PT基因TaPht1; 4進(jìn)行了克隆和功能分析,發(fā)現(xiàn)該基因在介導(dǎo)植株低磷逆境下的磷素吸收中發(fā)揮著重要作用[8]。本研究以中國(guó)春遺傳背景的整套B染色體雙端體為材料,對(duì)TaPht1; 4的染色體定位特征以及該小麥磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與低磷下不同磷利用效率小麥品種磷效率的聯(lián)系進(jìn)行了研究,旨在為今后小麥品種及資源的磷效率分子鑒定和耐低磷小麥磷高效遺傳改良提供理論依據(jù)。
參照郭程瑾等(2011)的方法[12],水培CS及整套B染色體組雙端體材料。三葉期時(shí),收獲各供試材料根系。采用基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa)提取各材料基因組DNA。以各材料基因組DNA為模板,采用TaPht1; 4特異引物,進(jìn)行目標(biāo)基因擴(kuò)增。擴(kuò)增TaPht1; 4的引物為5′-TTCACGACCTGGCCTGC (正向)和5′-TTACAAAATTTCCACGCTGT(反向)[8]。PCR擴(kuò)增條件為95℃ 4 min,隨后進(jìn)行28個(gè)下述循環(huán): 95℃ 1 min,55℃ 40 s,72℃ 1 min。通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè),進(jìn)一步對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物克隆和測(cè)序鑒定,闡明TaPht1; 4在染色體上的定位。
參照上述培養(yǎng)方法[12],水培CS、 整套B染色體組雙端體和不同磷素吸收效率品種至三葉期。然后轉(zhuǎn)入低磷脅迫(20 μmol/L Pi)進(jìn)行48 h處理。期間,在處理后24 h收獲根葉樣本,以低磷處理前的根、 葉作對(duì)照。采用Liu等(2013)的方法[8],進(jìn)行樣本總RNA提取、 RNA反轉(zhuǎn)錄和TaPht1; 4的半定量RT-PCR及實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)分析。 其中,以在小麥中呈組成型表達(dá)的微管蛋白基因(tubulin)作為上述各樣本分析中TaPht1; 4轉(zhuǎn)錄本均一化內(nèi)標(biāo)。擴(kuò)增tubulin的正向引物為5′-CATGCTATCCCTCGTCTCGACCT, 正向引物為5′-CGCACTTCATGATGGAGTTGTAT。
選擇各供試材料均勻的種子,萌發(fā)后分別轉(zhuǎn)入正常供磷(MS營(yíng)養(yǎng)液,1.2 mmol/L Pi)和低磷脅迫(調(diào)整含磷后的MS, 50 μmol/L Pi)2種處理下水培,具體參照郭程瑾等的方法[12]進(jìn)行。處理3周后,選取代表性幼苗,參照Guo等的方法[13]進(jìn)行單株干重和全磷含量測(cè)定。以單株干重和全磷含量的乘積計(jì)算出單株磷累積量,通過(guò)單株干重除以單株磷累積量求得磷效率。
本研究中PCR擴(kuò)增、 半定量RT-PCR和1PCR分析以及植株干重和磷吸收參數(shù)測(cè)定均進(jìn)行3次重復(fù)。采用SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件,對(duì)豐、 缺磷條件下供試材料的單株干重、 磷效率參數(shù)和qPCR中基因表達(dá)水平進(jìn)行平均值計(jì)算、 標(biāo)準(zhǔn)差分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性測(cè)定分析。
以中國(guó)春(CS)和分別缺少該品種B染色體組各長(zhǎng)、 短臂的整套雙端體為材料,采用PCR技術(shù),對(duì)高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaPht1; 4的染色體定位特征進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,與CS及其他雙端體材料能特異擴(kuò)增目標(biāo)基因的結(jié)果不同,在3BS中未擴(kuò)增到目標(biāo)基因(圖1A)。采用半定量RT-PCR和qPCR對(duì)豐、 缺磷條件下CS和各雙端體根、 葉中TaPht1; 4的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,豐磷條件下,各供試材料根、 葉片中均檢測(cè)不到TaPht1; 4的表達(dá)(資料未列出); 缺磷條件下,各供試材料葉片中也均未檢測(cè)到TaPht1; 4的表達(dá),但在根系中除3BS未檢測(cè)到TaPht1; 4表達(dá)外,CS和其他雙端體均具有較高的TaPht1; 4表達(dá)水平(圖1B,圖1C)。因此說(shuō)明,TaPht1; 4定位在3B染色體長(zhǎng)臂,呈低磷誘導(dǎo)和根系特異表達(dá)特征,該表達(dá)特征與先前的研究結(jié)果[8]一致。
圖1 TaPht1; 4在CS及其B染色體組雙端體的PCR擴(kuò)增和表達(dá)水平檢測(cè)Fig.1 PCR amplification and expression level of TaPht1; 4 in CS and its ditelosimic lines of B chromosome
豐磷條件下,3BS單株干重與CS沒(méi)有差異; 缺磷條件下,與CS相比,3BS單株干重顯著降低(圖2)。表明缺少TaPht1; 4及所在3B染色體長(zhǎng)臂后,植株的干物質(zhì)生產(chǎn)能力受到較大影響,這可能與由于缺乏該染色體臂喪失TaPht1; 4造成低磷逆境下植株的磷素吸收能力降低具有緊密聯(lián)系。喪失TaPht1; 4對(duì)豐磷條件下的植株干物質(zhì)生產(chǎn)沒(méi)有明顯影響,可能是由于該小麥PT基因不參與豐磷條件下植株磷素吸收或該條件下植株磷素吸收是由于其他PT成員介導(dǎo)所致。
圖2 豐、 缺磷條件下CS和3BS的單株干重Fig.2 The plant dry weight of CS and 3BS under conditions of Pi sufficience and Pi deprivation
與CS相比,豐、 缺磷條件下3BS植株全磷含量以及磷效率均無(wú)明顯改變(圖3)。豐、 缺磷條件下3BS的單株磷累積量與CS相比其表現(xiàn)規(guī)律與單株干重相同,表現(xiàn)為豐磷條件下兩者無(wú)明顯差異,但低磷條件下3BS的單株磷累積量較CS顯著減少(圖3),表明缺少3B染色體長(zhǎng)臂及相應(yīng)TaPht1; 4后,與CS相比3BS在豐、 缺磷條件下的植株含磷量和磷效率沒(méi)有變化,但低磷脅迫條件下的植株磷素吸收數(shù)量減少。低磷脅迫條件下3BS植株磷吸收量減少可能是其單株干重較CS顯著降低的重要原因。
以6個(gè)低磷下不同磷吸收效率的小麥品種為材料,對(duì)豐、 缺磷條件下各小麥品種TaPht1; 4的表達(dá)水平以及單株干重、 全磷含量、 磷累積量和磷效率進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,豐磷條件下,不同品種根、 葉中均檢測(cè)不到TaPht1; 4的表達(dá)(資料未列出),各品種間的單株干重、 全磷含量、 磷累積量和磷效率也無(wú)明顯差異(圖4); 缺磷條件下,不同小麥品種根系中的全磷含量和磷效率也無(wú)明顯差異,但根系中TaPht1; 4表達(dá)水平、 單株干重和單株磷累積量呈現(xiàn)明顯的變化規(guī)律,表現(xiàn)為隨著品種磷吸收效率的提高,TaPht1; 4表達(dá)水平隨之增高(圖5)、 單株干重和單株磷累積量也隨之增大(圖4)。上述結(jié)果表明,低磷脅迫條件下TaPht1; 4的表達(dá)水平與小麥品種在低磷逆境下的磷素吸收和干物質(zhì)積累具有緊密聯(lián)系。
圖3 豐、 缺磷條件下CS和3BS的全磷含量、 單株磷累積量和磷效率Fig.3 Total P content, plant dry weight and P use efficiency of CS and 3BS under Pi sufficiency and Pi deprivation
圖4 豐、 缺磷條件下不同磷吸收效率小麥品種的單株干重、 全磷含量、 磷累積量和磷效率Fig.4 The plant dry weight, total P content, accumulative P amount and P use efficiency in wheat cultivars with different low-P use efficiencies under P sufficiency and P deprivation
圖5 缺磷條件下不同磷吸收效率小麥品種根系中TaPht1; 4的表達(dá)水平Fig.5 The expression levels of TaPht1; 4in the roots of wheat cultivars with different low-P use efficiencies under P deprivation
磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PT)在介導(dǎo)植株吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)磷素的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明,植物根系對(duì)生長(zhǎng)介質(zhì)中磷素的吸收以及已吸收至植株體內(nèi)磷素在組織和細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn),是由位于細(xì)胞質(zhì)膜上的PT介導(dǎo)完成的。期間由H+-ATPase提供驅(qū)動(dòng)H+與Pi共轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)力[1,14]?;蚬δ芊治霭l(fā)現(xiàn),部分特定植物種屬PT成員,在增強(qiáng)低磷逆境下植株的磷素吸收能力中發(fā)揮著重要功能[8,15-18]。
高親和PT基因具有很強(qiáng)的親和Pi能力,在表達(dá)上多呈根系特異/優(yōu)勢(shì)表達(dá)且受到外界低磷逆境誘導(dǎo)的特征[1-2,19-22]。上述表達(dá)特征及親和Pi的生化特性,是該類別PT成員構(gòu)成低磷脅迫條件下根系吸收介質(zhì)中磷素主體的重要分子基礎(chǔ)。作者的前期研究表明,TaPht1; 4是歸屬于PHT1家族的小麥高親和PT成員,具有補(bǔ)償缺失磷素吸收酵母突變體的磷素吸收能力,在增強(qiáng)植株抵御低磷逆境中發(fā)揮著重要功能[8]。本研究采用分別僅缺失B染色體組各長(zhǎng)、 短臂的整套雙端體為材料,利用PCR和基因表達(dá)檢測(cè)技術(shù)對(duì)TaPht1; 4在染色體上的定位進(jìn)行了鑒定。表明該小麥高親和PT基因定位在3B染色體的長(zhǎng)臂上。缺失該染色體臂的雙端體3BS,低磷脅迫條件下植株的干物質(zhì)生產(chǎn)能力和單株磷累積量與對(duì)照中國(guó)春(CS)以及其他B染色體組雙端體相比明顯下降。表明位于3B染色體長(zhǎng)臂的TaPht1; 4,通過(guò)對(duì)低磷逆境特異應(yīng)答及表達(dá)蛋白對(duì)介質(zhì)中Pi高度親和,在較大程度上調(diào)控低磷條件下植株的磷素吸收能力,進(jìn)一步對(duì)低磷逆境下植株的干物質(zhì)生產(chǎn)能力產(chǎn)生重要影響。
植株對(duì)豐、 缺磷條件下介質(zhì)中磷素的吸收,是由高、 低磷吸收運(yùn)載系統(tǒng)分別介導(dǎo)完成的[1,3]。其中,高、 低親和PT成員分別是上述磷素吸收運(yùn)載系統(tǒng)的重要組分[1-3]。本研究發(fā)現(xiàn),在豐磷條件下,與中國(guó)春(CS)相比,3BS以及其他B染色體組雙端體的單株干重、 全磷含量、 單株磷累積量和磷效率沒(méi)有差異。表明該供磷水平下植株的磷素吸收能力和干物質(zhì)生產(chǎn)能力與3B染色體長(zhǎng)臂的缺失以及TaPht1; 4的存在與否無(wú)關(guān)。這與TaPht1; 4是高親和運(yùn)載系統(tǒng)組分, 該系統(tǒng)主要參與低磷逆境下植株的磷素吸收,而在豐磷條件下植株對(duì)介質(zhì)的磷素吸收由其他低親和PT成員介導(dǎo)有關(guān)。有關(guān)參與豐磷條件下小麥磷素吸收的低親和PT基因及其調(diào)控植株吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)磷素的分子機(jī)理有待進(jìn)一步探討。
小麥不同基因型(品種)在磷素吸收和利用能力上存在明顯的遺傳學(xué)差異[9]。闡明小麥抵御低磷逆境能力的分子標(biāo)記對(duì)于耐低磷小麥遺傳學(xué)材料鑒定、 磷高效小麥育種后代材料篩選以及小麥品種(品系)的磷效率評(píng)價(jià)具有重要指導(dǎo)意義[8, 10-11]。本研究對(duì)低磷脅迫條件下不同低磷吸收效率的小麥品種中TaPht1; 4表達(dá)水平、 干物質(zhì)生產(chǎn)特征和磷素吸收能力的研究表明,不同磷吸收效率小麥品種低磷逆境下的單株干重和單株磷累積量與TaPht1; 4的表達(dá)水平密切相關(guān)。因此,TaPht1; 4可作為低磷脅迫下小麥磷素吸收和干物質(zhì)生成能力的分子評(píng)價(jià)指標(biāo)。
綜上,本研究表明, 小麥高親和PT基因TaPht1; 4定位在3B長(zhǎng)臂。豐磷條件下,與CS相比,3BS的單株干重、 全磷含量、 磷累積量和磷效率沒(méi)有改變; 低磷條件下,3BS的單株干重和磷累積量較CS顯著降低。豐、 缺磷條件下,不同磷吸收效率小麥品種TaPht1; 4的表達(dá)水平與植株干重和單株磷累積量密切相關(guān)。TaPht1; 4能顯著增強(qiáng)小麥在低磷逆境下的磷素吸收能力,可作為小麥品種耐低磷能力的分子評(píng)價(jià)參考指標(biāo)。
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