表皮生長因子受體3在結腸癌中的表達及其與結腸癌細胞增殖凋亡的關系研究

高 俊，呂 龍，陳 功

表皮生長因子受體3(Her3)基因編碼的表皮生長因子受體(EGFR)受體酪氨酸激酶3，由于其沒有胞內(nèi)信號傳遞域，常與其他表皮生長因子受體形成異二聚體轉(zhuǎn)導生長信號。已有的報道表明，Her3在包括乳腺癌、結腸癌、前列腺癌及膀胱癌的眾多腫瘤中高表達[1-3]。本研究利用siRNA技術研究，下調(diào)Her3在結腸癌細胞中的表達，研究Her3對于結腸癌細胞增殖凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2007年1月至2011年12月我院行結腸癌切除術男性患者60例，平均年齡47.8歲；女性患者30例，平均年齡42.9歲。每例均在無菌條件下同時取癌組織及手術切緣處(距腫瘤5 cm以上)正常結腸黏膜組織各一塊。非典型增生的標本90例，來源于腸鏡檢查摘除，并經(jīng)由病理科確診。

1.2 方法

1.2.1 熒光實時定量RT-PCR 提取采集研究對象的組織，采用Trizol抽提法提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司)說明書合成cDNA，反應體系為20 μl。5×PCR緩沖液4 μl，OligodT以及隨機六聚體引物各1 μl，總RNA為2 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶混合物1 μl，加雙蒸水至20 μl。引物的設計與合成利用生物信息學知識及RT-PCR對引物的要求，使用Oligo6.0設計軟件設計，由上海生物工程有限公司合成，引物序列及擴增長度詳見表1。RT-PCR使用TAKARA公司的sybergreenI mix試劑盒，反應體系為20 μl，其中2×賽柏格林(Sybergreen)預混液 10 μl，校正染料0.3 μl，互補鏈脫氧核糖核酸(cDNA) 1.5 μl，上下游引物各0.5 μl，加雙蒸水至20 μl。使用ABI公司7300型real-time PCR儀，反應條件為：94℃ 5 min，94 ℃15 s，58 ℃15 s，72 ℃15 s，共35個循環(huán)，擴增反應完成后又進行了溶解曲線的制作，確保擴增的特異性。

1.2.2 免疫組織化學 60例結腸癌標本4%的中性甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋的腫瘤組織切至4 μm厚切片，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水，室溫中30 ml/L過氧化氫甲醇溶液中浸泡30 min，以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。切片在EDTA(0.01 mol/L，pH 8.0)中煮20 min以修復抗原。PBS漂洗3次后，切片用正常山羊血清孵育10 min以阻斷非特異性反應。一抗相應抗原單克隆抗體(1∶500)在濕盒中4 ℃過夜，PBS漂洗3次，滴加二抗試劑，室溫下孵育10 min后PBS漂洗3次，滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min后再用PBS漂洗3次，最后二甲胺二氮苯(DAB)顯色，蘇木素復染、透明、脫水、封片。以PBS替代一抗行陰性對照。

1.2.3 免疫組織化學染色結果判定 使用專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus(版本號5.0)分析圖片，每張切片選取5個視野(×200)，經(jīng)軟件分析求得平均光密度值(integrated optical density, IOD)，用此種方法對每張切片中Her3的表達做出量化的評價。

1.2.4 轉(zhuǎn)染 使用Invitrogen公司的Lipofectamine2000進行轉(zhuǎn)染，具體如下：轉(zhuǎn)染前1天按5×104/孔的密度接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后進行轉(zhuǎn)染，將0.8 μg psilencer 2.1-u6-Her3及其對應空質(zhì)粒對照按照說明書方法轉(zhuǎn)染SW480及Lovo細胞，Western-blot驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 AnnexinV-PI共染檢測細胞凋亡 利用2%過氧化氫刺激誘導細胞凋亡，細胞包括：Her3表達沉默及對應空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照細胞；2%過氧化氫刺激12 h后收集細胞，用PBS洗滌細胞2次；按照試劑盒說明書(美國invitrogen公司，貨號V13241)加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞；并加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫、避光、反應15 min，流式細胞儀測定。

1.2.6 MTS摻入法檢測細胞增殖 將SW480，Lovo以及siRNA處理細胞以每孔5×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μl。在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。分別在種入細胞的6，12，24及72 h進行MTS摻入及比色，每組細胞每個時間點設3個復孔，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.2.7 Western-blot 將SW480，Lovo以及siRNA處理細胞以每孔5×105個細胞，按細胞數(shù)量加入裂解液，冰浴后，離心取上清，加入上樣緩沖液，95 ℃煮5 min；按每個樣品30 μg上樣，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)膜，利用相應抗體和兔二抗孵育后，利用ECL曝光。

1.3 統(tǒng)計學處理

結腸癌及正常組織中Her3的表達比較應用單因素方差分析(SPSS10.0統(tǒng)計學軟件)，以P<0.05為有差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Her3在人結腸癌組織中的表達

利用real-time PCR及免疫組織化學染色分析Her3在人結腸癌中的表達，結果表明，Her3在人結腸癌組織中轉(zhuǎn)錄水平較正常組織顯著增高(圖1)，P<0.01。免疫組織化學結果表明，Her3在結腸癌組織中普遍呈陽性(79/90，87.8%陽性率)， 顯著高于非典型增生組織(27/90, 30%)及正常結腸黏膜組織(15/90, 16.7%)，利用圖像分析軟件，量化免疫組化染色，結果與陽性率比較一致，即結腸癌中Her3蛋白的表達顯著高于非典型增生組織及正常黏膜組織(見圖2、3)。

圖1 real-time PCR檢測人結腸癌組織中Her3基因的表達

圖2 軟件統(tǒng)計免疫組織化學染色Her3在人結腸癌(CC)，非典型增生(GD)及正常結腸組織(Normal)中的表達

圖3 免疫組織化學染色Her3在人結腸癌(A 陽性，B陰性)，非典型增生(×100)及正常結腸組織中的表達(×100)

2.2 結腸癌及癌旁組織中Her3的表達與AKT信號通路激活的相關性

利用Western-blot檢測結腸癌及癌旁組織中Her3的表達及磷酸化AKT(Ser473)的表達，結果表明Her3在結腸癌組織中高于配對的癌旁組織(圖4)。通過圖像軟件量化條帶灰度值，根據(jù)Her3和p-AKT的灰度值進行相關性分析，結果表明Her3的表達與AKT信號的激活呈正相關(r2=0.21,P=0.012)，見圖5。

圖4 Western-blot檢測人結腸癌中AKT通路與Her3的表達

圖5 Her3表達與AKT通路激活的相關性分析檢驗

2.3 Her3對結腸癌細胞增殖及凋亡的影響

利用siRNA技術干擾結腸癌細胞株SW480及Lovo中Her3的表達，通過Western-blot技術檢測Her3表達，與轉(zhuǎn)染對照序列的細胞相比較，兩種干擾片段s1及s2能夠顯著下調(diào)Her3在兩種結腸癌細胞中的表達，干擾效果尤以s2為佳。因此，我們選用s2干擾序列下調(diào)兩種結腸癌細胞中Her3的表達，建立穩(wěn)定表達細胞系，SW480-Her3-siRNA和Lovo-Her3-siRNA(圖6)。利用MTS摻入實驗分析Her3對結腸癌細胞增殖的影響，分別選擇48 h、72 h及96 h分析細胞的增殖情況，與對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞株相比，在72 h和96 h，Her3表達下調(diào)后，細胞的增殖水平顯著下降(SW480：72 h，P=0.024；96 h，P=0.017。Lovo：72 h，P=0.021；96 h，P=0.013)，見圖7。利用順鉑(1 μg/ml)體外誘導細胞凋亡，作用24 h后，利用AnnexinV-PI檢測細胞凋亡情況，結果表明Her3下調(diào)能夠顯著促進結腸癌細胞SW480及Lovo的凋亡(SW480，P=0.004；Lovo：P=0.007)，見圖8。

圖6 Western-blot檢測Her3蛋白的表達

圖7 MTS試驗研究Her3對結腸癌細胞增殖的影響

圖8 AnnexinV-PI摻入試驗研究Her3對結腸癌細胞株凋亡的影響

2.4 AKT及MAPK通路與Her3表達下調(diào)的相關性 利用Western-blot檢測細胞中相關蛋白的表達，分別檢測AKT和MAPK兩條通路的激活情況。加入Her3配體EGF，處理6 h，Her3表達下調(diào)后，與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細胞相比，SW480-Her3-siRNA及Lovo-Her3-siRNA 中AKT及MAPK的激活顯著下降，見圖9。

3 討論

關于腫瘤細胞表皮生長因子信號轉(zhuǎn)導的途徑，腫瘤學術界的研究已十分透徹，表皮生長因子可通過其受體——生長因子受體家族向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導，通過PI3K-AKT及MAPK-ERK等信號通路引發(fā)系列生物學效應：包括增殖，生存力，細胞遷移等。該家族包括HER1(erbB1, EGFR)、HER2(erbB2, NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)[4-5]。HER家族在細胞生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。由于Her3本身沒有胞內(nèi)信號傳遞域，所以Her3必須與其他受體形成異二聚體發(fā)揮轉(zhuǎn)導信號的作用，以往以及本研究都表明Her3在結腸癌中顯著高表達，而且我們的而研究表明Her3的表達與AKT的激活呈正比，說明Her3可結合表皮生長因子通過AKT通路促進腫瘤的各種生物學行為[6-7]。

圖9 Western-blot 檢測Her3表達下調(diào)后AKT及MAPK通路的激活情況

Her3與其他表皮生長因子受體形成異二聚體對于細胞分裂十分重要，一旦這種二聚體的功能發(fā)生障礙，細胞的增殖水平就會受到很大的影響，我們的結果提示即便細胞受到表皮生長因子的刺激，Her3的缺失仍然降低了其信號在細胞內(nèi)的傳遞，從生物學上表現(xiàn)為增殖水平的下降和腫瘤藥物敏感性的提高，而這些都可能是基于PI3K-AKT和MAPK信號通路。本結果充分的說明雖然Her3缺乏胞內(nèi)信號傳遞域，但Her3的存在能夠增加表皮生長因子信號的傳遞的效率。

因此，我們覺得Her3是一種有效的治療結腸癌的靶點，其可能的機制是影響表皮生長因子及其下游增殖及生存相關通路。

參考文獻：

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