循環(huán)機(jī)械壓力誘導(dǎo)下兔椎間盤退變器官模型的建立及意義*

徐宏光章平治宋俊興胡斌趙泉來呂坤鐘民張夢(mèng)瑩所起鳳

（皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 1.脊柱外科；2.中心實(shí)驗(yàn)室，安徽蕪湖 241001）

循環(huán)機(jī)械壓力誘導(dǎo)下兔椎間盤退變器官模型的建立及意義*

徐宏光1**章平治1宋俊興1胡斌1趙泉來1呂坤2鐘民2張夢(mèng)瑩2所起鳳2

（皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 1.脊柱外科；2.中心實(shí)驗(yàn)室，安徽蕪湖 241001）

背景：力學(xué)因素是導(dǎo)致椎間盤退變（IDD）的重要誘因，建立力學(xué)相關(guān)性 IDD 的器官模型能為 IDD 機(jī)制的研究提供理想的模型基礎(chǔ)。

目的：建立兔椎間盤器官模型，并施以循環(huán)機(jī)械壓力，探究循環(huán)機(jī)械壓力載荷對(duì)IDD 的影響。

方法 ：6 月齡新西蘭大白兔隨機(jī)分為加力組和對(duì)照組，靜脈給予 1.3 ml肝素（5000 U/ml），待肝素體內(nèi)循環(huán) 5 min 后處死。無菌條件下完整取出帶部分椎骨的腰段椎間盤，放入 20%胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。加力組應(yīng)用加力器施以 0.2 MPa 壓力值，每日加壓 1 次 ，每次 30 min。經(jīng) 過 各 個(gè) 時(shí) 段 的 培 養(yǎng)后，蘇 木 精-伊紅（HE）染色觀察椎間盤 大 體 組 織 形 態(tài) 學(xué)變化；氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）染色及 4',6-二瞇基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染檢測(cè)椎間盤細(xì)胞成活率；Realtime RT-PCR 和Western-blotting 檢測(cè)蛋白多糖（AGN）、Ⅱ型膠原（COLⅡ）的 mRNA 和蛋白表達(dá)。

結(jié)果：對(duì)照組和加力組培養(yǎng)至第 7 d的組織形態(tài)學(xué)無明顯變化，培養(yǎng)至第 14 d均表現(xiàn)為組織形態(tài)學(xué)破壞，且以加力組表現(xiàn)更為明顯。對(duì)照組培養(yǎng)至第 7 d 的細(xì)胞成活率及 AGN、COLⅡ表達(dá)與 0 d 相比無明顯變化；對(duì)照組培養(yǎng)第 14 d與 0 d 比較，培養(yǎng)第 7 d 加力組與對(duì)照組比較，培養(yǎng)第 14 d加力組與對(duì)照組比較，均表現(xiàn)為細(xì)胞成活率明顯下降，AGN、COLⅡ表達(dá)下調(diào)。

結(jié)論：成功建立短周期兔椎間盤體外器官模型，并在此模型基礎(chǔ)上闡明循環(huán)機(jī)械壓力載荷可直接導(dǎo)致椎間盤退變樣改變。

器官培養(yǎng)；循環(huán)機(jī)械壓力；椎間盤退變

Background:The mechanical factor is the main incentive of intervertebral disc degeneration.The establishment of an in vitro organ culture model can provide a basic condition for studying the mechanism of intervertebral disc degeneration.

Objective:To develop an in vitro organ culture model of rabbit intervertebral disc,and to investigate the relationship between cyclic mechanic pressure and intervertebral disc degeneration.

Methods:New Zealand white rabbits aged 6 months old were randomly divided into cyclic mechanical pressure group and control group.Heparin(5000 U/ml,1.3 ml)were intravenously infused,then the animals were killed 5 minutes later.Then intervertebral discs were taken out with part of the vertebrae from lumbar spines by asepsis and cultured in medium with 20%fetal bovine serum supplemented.Cyclic mechanical pressure at 0.2 MPa was applied once every 30 minutes in a day. The change of histomorphology,cell viability and mRNA and protein expression levels of aggrecan,typeⅡcollagen within intervertebral disc tissue were assessed by HE staining,NBT-DAPI,real time RT-PCR and Western-blotting,respectively,at different periods.

Results:In the control group,there were no significant defferences in terms of the changes in histomorphology,cell viability and mRNA and protein expression levels of aggrecan and typeⅡ collagen before culture and 7 days after culture.Obvious damage in histomorphology were seen in both control group and cyclic mechanical pressure group 14 days after culture,especially in later one.The cell viability and the expression level of typeⅡcollagen and aggrecan were significantly decreased at 7,14 days after culture in the cyclic mechanical pressure group and 14 days in the control group.

Conclusions:The short-term in vitro organ culture of rabbit intervertebral disc is successfully performed in the study.Cyclic mechanical pressure can induce degeneration of the intervertebral disc in this model.

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration,IDD）是脊柱退行性疾病最常見的病因[1-3]，年齡、營(yíng)養(yǎng)、基因、力學(xué)等因素與 IDD 密切相關(guān)[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，將不平衡的壓力施于頸椎可導(dǎo)致不同程度 IDD 的發(fā)生[7-9]，我們可以認(rèn)為異常應(yīng)力是導(dǎo)致IDD的重要因素。

隨著對(duì) IDD 研究的不斷深入，建立一種較好的IDD模型對(duì)于研究其退變機(jī)制具有重要意義。眾多學(xué)者研究指出，IDD的在體動(dòng)物模型不利于對(duì)細(xì)胞和基 質(zhì) 代 謝 疾 病 以 及 信 號(hào) 傳 導(dǎo) 異 常 的 探 究[10-13]。 另 一些學(xué)者亦發(fā)現(xiàn)，體外單層細(xì)胞培養(yǎng)由于失去了特有的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境而致細(xì)胞表型丟失，且細(xì)胞增殖率低[5,14]。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)椎間盤器官整體培養(yǎng)漸趨重視[15]，Haschtmann 等[16]通過實(shí)驗(yàn)研究證明，帶有完整軟骨終板的椎間盤模型培養(yǎng)的時(shí)間較長(zhǎng)，不失為研究IDD機(jī)制的優(yōu)質(zhì)體外模型。本研究擬建立類似于體內(nèi)生理環(huán)境的兔椎間盤器官模型，并在此模型基礎(chǔ)上施以一定值一定周期的循環(huán)機(jī)械壓力（cyclic mechanic pressure,CMP）載荷，研究壓力刺激與 IDD 的關(guān)系 ，探索力學(xué)刺激相關(guān)性 IDD 器官培養(yǎng)的實(shí)用技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只清潔級(jí)新西蘭大白兔，6月齡，雌雄不限，體重 1800～2100 g，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供[合格證號(hào)：SCXK（蘇）2012-0008]。

1.2 試劑和儀器

動(dòng)物椎間盤加力器（專利號(hào)：ZL 2011 2 0575941. X；專利權(quán)人：徐宏光）。青鏈雙抗（Gibico 公司，美國(guó)）；DMEM/F12（Gibico 公司 ，美 國(guó)）；胎 牛 血 清（Gibico 公司，美國(guó)）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，中國(guó)）；氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）（Amresco，美國(guó)）；4’,6-二瞇基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma，美國(guó)）；Trizol（Invitrogen，美國(guó)）；PCR 反應(yīng)體系和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas，美國(guó)）；Realtime-PCR 儀（Roche，瑞士）；Realtime-PCR 試劑盒（Takara，日本）；BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物技術(shù)公司，中國(guó)）；蛋白多糖（aggrecan,AGN）、Ⅱ型膠原（type Ⅱ collagen,COL Ⅱ）多克隆抗體（Abcam公司，美國(guó)）；Odyssey紅外掃描儀（LICOR Biosciences，美國(guó)）；5%CO2培養(yǎng)箱（Forma公司，美國(guó)）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；熒光顯微鏡（Nikon，日本）；石蠟切片機(jī)（Leica，德國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 循環(huán)壓力刺激下的兔椎間盤整體器官的獲得與培養(yǎng)：每次隨機(jī)選取 4 只新西蘭大白兔，靜脈給予 1.3 ml肝素（5000 U/ml），待肝素體內(nèi)循環(huán) 5 min 后行空氣注射法處死[17]。無菌條件下手術(shù)完整取出帶部分椎骨的L1-2、L2-3、L3-4 及 L4-5 椎間盤，并分別作為一個(gè)整體器官，共16個(gè)。隨機(jī)分為加力組和對(duì)照組各8個(gè)，置入含有 20%胎牛血清（FBS）、DMEM/F12（1:1）、青鏈雙抗（青霉素 50 U/ml和鏈霉素 50 μg/ml）培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿里，再放進(jìn)37℃和5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，每天更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)時(shí)間依次為0、7、14 d。根據(jù)相 關(guān)文獻(xiàn)提示，對(duì)包括兔的小型動(dòng)物脊柱施以 0.1～0.3 MPa，每 12～24 h 加壓 1 次，每次 30～120 min 的循環(huán) 壓 力 是 一 較 合 理 的 區(qū) 間[18-22]。 本 研 究 根 據(jù) 以 上 觀點(diǎn)結(jié)合試驗(yàn)摸索，將加力組椎間盤器官在無菌條件下 安 裝 好 加 力 器 ，每 次 給 予 壓 力 刺 激 值 為 0.2 MPa，每日加壓 1 次，每次 30 min。

1.3.2 觀察兩組椎間盤器官的組織學(xué)改變：分別取出培養(yǎng) 0、7、14 d 對(duì)照組和加力組的椎間盤器官，10%福爾馬林固定，石蠟包埋后按椎間盤器官矢狀面進(jìn)行切片，切片厚度為 7 μm。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染色法在光鏡下觀察兩組椎間盤的組織學(xué)變化，并根據(jù)湯普森分級(jí)系統(tǒng)對(duì)所觀察圖像進(jìn)行退變程度分級(jí)[23]（表 1）。

1.3.3 觀察兩組椎間盤器官的細(xì)胞成活率：分別于培養(yǎng) 0、7、14 d 在對(duì)照組和加力組椎間盤器官培養(yǎng)液中加入濃度為 10 mg/ml的 NBT 液 240 μl，吹打混勻，8 h后取出椎間盤，PBS液漂洗3次，10%福爾馬林固定48 h，石蠟包埋切片，切片厚度為 7 μm，光鏡觀察并獲取圖像，核熒光DAPI復(fù)染，通過熒光顯微鏡觀察并獲取同一視野內(nèi)圖像。僅被NBT著色細(xì)胞視為活細(xì)胞，DAPI熒光著色細(xì)胞視為活細(xì)胞與死亡細(xì)胞總和，即總細(xì)胞數(shù)，按下面公式計(jì)算成活細(xì)胞百分比：

1.3.4 觀察兩組椎間盤器官 AGN 和 COLⅡ的表達(dá)變化：① Realtime RT-PCR 檢測(cè)：測(cè)定兩組椎間盤組織培養(yǎng)各時(shí)段的軟骨細(xì)胞標(biāo)志性基因AGN和COLⅡ的mRNA表達(dá)量。各組分別取250 μg研磨成組織勻漿 ，按 Trizol試 劑 盒 說 明 提 取 總 RNA，取 3 μg 按 Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒說明書行一步法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將 cDNA稀釋5 倍，進(jìn)行 Realtime RT-PCR，各基因的引物序列及擴(kuò)增片段見 表 2。 反 應(yīng) 條 件 ：95℃ 預(yù) 變 性 30 s；95℃ 變 性 5 s、60℃退火延伸 25 s，擴(kuò)增 50 個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析：95℃ 0 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s；溶解曲線為單一峰說明是特異性擴(kuò)增。滅菌超純水作為陰性對(duì)照，每個(gè)模 板做 3 個(gè)復(fù)孔，三 磷 酸甘油醛脫 氫 酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）為內(nèi)參，結(jié)果 使 用 相 對(duì) 定 量 2-△△CT方 法 分析[24]表 2）。 ② Western-blotting 檢測(cè)：對(duì)兩組椎間盤組織培養(yǎng)各時(shí)段的軟骨細(xì)胞標(biāo)志性基因AGN和COLⅡ的蛋白表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。蛋白提取定量變性，精確稱取20 μg，按比例加入5×上樣緩沖液，提取的總蛋白樣品經(jīng)分光光度計(jì)定量。取 20 μg 樣品加入到 12%的 SDS-聚丙酰胺凝膠電泳，待溴芬蘭進(jìn)入凝膠底部后，將樣品印跡到硝酸纖維素膜上，加入一抗4℃過夜，二抗1 h后應(yīng)用Odyssey紅外掃描儀成像。

表1 湯普森分級(jí)系統(tǒng)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用方差檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)改變（HE染色）

與培養(yǎng)0 d相比較，加力組與對(duì)照組椎間盤培養(yǎng)至第7 d的軟骨終板、纖維環(huán)及髓核組織大體組織學(xué)結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)明顯改變及破壞；培養(yǎng)至第14 d的纖維環(huán)出現(xiàn)裂傷、結(jié)構(gòu)紊亂，與髓核組織界限不清，髓核組織出現(xiàn)纖維化、體積縮小，且以加力組椎間盤整體培養(yǎng)器官的改變和破壞更為明顯。湯普森分級(jí)：兩組培養(yǎng) 0 d 和第 7 d 均為Ⅰ級(jí)，第 14 d 為Ⅲ～Ⅳ級(jí)（圖 1）。

表 2 Realtime RT-PCR 引物序列

2.2 椎間盤細(xì)胞成活率（NBT染色及DAPI復(fù)染）

對(duì)照組和加力組組內(nèi)比較采用方差檢驗(yàn)：與0 d相比較，對(duì)照組培養(yǎng)至第 7 d 的細(xì)胞成活率無明顯下降（P=0.719，圖 2），培養(yǎng)至第 14 d 的細(xì)胞成活率下降（P=0.019，圖 2）；與 0 d 相 比 較 ，加 力 組 培 養(yǎng) 至 第 7 d的細(xì)胞成活率下降（P=0.031，圖 2）；培養(yǎng)至第 14 d 的細(xì) 胞成活率下降更為明顯（P=0.000，圖 2）。對(duì)照組與加力組組間比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)：培養(yǎng) 0 d 時(shí)，兩組間細(xì)胞成活率無明顯變化（P=0.996，表3，圖2）；培 養(yǎng)至 第 7 d 時(shí) ，加力 組的 細(xì) 胞成 活率 低 于對(duì) 照組（P=0.043，表 3，圖 2）；培養(yǎng)至第 14 d 時(shí)，加力組的細(xì)胞成活率下降更為明顯（P=0.000，表3，圖 2）。

2.3 Realtime RT-PCR 檢測(cè)

2.3.1 AGN 表達(dá)：與 0 d 相比較，對(duì)照組培養(yǎng)至第 7 d 的AGN 表達(dá)無明顯下調(diào)，（P=0.932，表 4），培養(yǎng)至第 14 d的 AGN表達(dá)下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.002，表 4）；培養(yǎng)第 7 d兩組間比較，加力組 AGN表達(dá)下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.001，表 4）；培 養(yǎng) 第 14 d 兩 組 間 比 較 ，加 力 組AGN表達(dá)明顯下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000，表4）。

2.3.2 COLⅡ表達(dá)：與 0 d 相比較，對(duì)照組培養(yǎng)至第 7 d的 COLⅡ 表 達(dá) 無 明 顯 下 調(diào) ，（P=0.694，表 5），培 養(yǎng) 至第 14 d 的 COLⅡ表 達(dá)明顯下 調(diào) ，有統(tǒng) 計(jì) 學(xué)差異（P= 0.003，表 5）；培 養(yǎng) 第 7 d 兩 組 間 比 較 ，加 力 組 COLⅡ表達(dá)下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.002，表 5）；培養(yǎng)第 14 d兩組間比較，加力組COLⅡ表達(dá)明顯下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.001，表 5）。

2.4 Western-blotting 檢測(cè)

AGN、COLⅡ基因在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)：以β-actin為內(nèi)參。對(duì)照組 7 d 與 0 d 比較，蛋白表達(dá)無明顯下調(diào)；對(duì)照組 14 d 與 0 d 比較，蛋白表達(dá)明顯下調(diào)；培養(yǎng)第 7 d兩組間比較，加力組蛋白表達(dá)明顯下調(diào)；培養(yǎng)第 14 d 兩組間比較，加力組蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，且隨著加力培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)（圖5）。

圖1 加力組和對(duì)照組器官培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)椎間盤矢狀面石蠟切片HE染色觀察椎間盤大體組織形態(tài)學(xué)的變化（倒置相差顯微鏡，×40）

圖2 對(duì)照組與加力組兔椎間盤器官培養(yǎng)在各時(shí)間點(diǎn)相同視野活細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)（熒光顯微鏡，×200）

3 討論

3.1 器官培養(yǎng)對(duì)力學(xué)相關(guān)性IDD 研究的意義

引起 IDD 的病因非常復(fù)雜，但有充分證據(jù)證明在 IDD 的發(fā)病機(jī)制中異常應(yīng)力扮演重要角色[25]。然而目前仍缺乏合適的研究模型，使研究受到局限。

椎間盤應(yīng)力載荷傳導(dǎo)的在體動(dòng)物研究因不能充分控制椎間盤運(yùn)動(dòng)節(jié)段的載荷參數(shù)而使研究變得異常復(fù)雜，難以得到確切的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，研究結(jié)果難以把握[26]。另一方面，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究能很好地控制應(yīng)力載荷，但因離開其原有的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境而容易導(dǎo)致細(xì)胞表型丟失，細(xì)胞難以維持其活力，從而限制該技術(shù)在此領(lǐng)域的研究。與以上方法相比較，建立器官培養(yǎng)系統(tǒng)的方法既能使椎間盤細(xì)胞不脫離其生存的基質(zhì)環(huán)境，又能很好地進(jìn)行應(yīng)力載荷控制，較好地克服以上技術(shù)缺陷，不失為研究力學(xué)相關(guān)性IDD較為理想的模型。

3.2 器官來源的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

椎間盤整體器官培養(yǎng)模型最初來源于小型動(dòng)物，因?yàn)槠渥甸g盤有較高的面積-容積比例，有利于營(yíng)養(yǎng)向椎間盤各個(gè)部分彌散滲透以及代謝物的排出，故而小型動(dòng)物的椎間盤作為器官培養(yǎng)的來源較為理想[27]。 Seol等[26]將 大鼠 椎 間 盤 和 兔 椎 間 盤 同 時(shí) 進(jìn) 行整體器官培養(yǎng)，之后分別對(duì)其組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞活力、基質(zhì)及標(biāo)志性基因表達(dá)進(jìn)行觀察和分析發(fā)現(xiàn)，兔椎間盤器官培養(yǎng)后的上述各指標(biāo)均較大鼠穩(wěn)定。結(jié)論認(rèn)為，小型動(dòng)物中兔椎間盤作為器官培養(yǎng)來源較大鼠椎間盤更具穩(wěn)定性。相比嚙齒類的大鼠，兔的種屬更接近于人類，且廣泛應(yīng)用于IDD的研究領(lǐng)域，獲得椎間盤器官的手術(shù)方式與大鼠相比無需應(yīng)用顯微外科技術(shù)，技術(shù)操作上更加簡(jiǎn)單。因而，本研究中采用新西蘭大白兔作為椎間盤整體器官培養(yǎng)的來源。

表3 對(duì)照組與加力組兔椎間盤器官培養(yǎng)在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率（,%）

表3 對(duì)照組與加力組兔椎間盤器官培養(yǎng)在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率（,%）

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表 4 Real-time RT-PCR 檢測(cè)器官培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和加力組兔椎間盤 AGN mRNA 表達(dá)量（）

表 4 Real-time RT-PCR 檢測(cè)器官培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和加力組兔椎間盤 AGN mRNA 表達(dá)量（）

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表 5 Real-time RT-PCR 檢測(cè)器官培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和加力組兔椎間盤 COLⅡmRNA 表達(dá)量（）

表 5 Real-time RT-PCR 檢測(cè)器官培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和加力組兔椎間盤 COLⅡmRNA 表達(dá)量（）

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3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前應(yīng)用抗凝劑的意義

Lee 等[28]報(bào) 道，他們 在進(jìn) 行綿 羊椎 間盤 體外 器 官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，在處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前給予抗凝劑肝素，以預(yù)防椎間盤器官離體后內(nèi)部小血管內(nèi)凝血塊形成，使小血塊阻止培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向椎間盤器官內(nèi)部擴(kuò)散。Zhang 等[17]進(jìn)行兔椎間盤體外器官培養(yǎng)時(shí)，在處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前，每只兔靜脈給予 1.3 ml肝素（5000 U/ml），顯示離體后的椎間盤器官小血管絕大部分通暢。這被認(rèn)為是保證椎間盤營(yíng)養(yǎng)通道的重要措施。本實(shí)驗(yàn)中亦采用了上述方法。

3.4 器官模型的營(yíng)養(yǎng)供給及離體器官腫脹預(yù)防措施

圖 5 Western blotting檢測(cè)器官培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和加力組兔椎間盤AGN、COLⅡ蛋白表達(dá)量

眾所周知，椎間盤的營(yíng)養(yǎng)途徑主要是終板軟骨途徑和纖維環(huán)外周通路，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要以彌散的方式通過椎間盤向其深處滲透[29]。為進(jìn)一步保證離體后的椎間盤器官有充足的營(yíng)養(yǎng)供給，除上述采用小型動(dòng)物椎間盤及動(dòng)物處死前給予肝素抗凝等措施外，眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，為建立有效的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)彌散梯度，培養(yǎng)液內(nèi)胎牛血清的濃度應(yīng)該調(diào)高[26,30-32]。針對(duì)調(diào)整的濃度值，各家報(bào)道不一，有的調(diào)整至14%，有的調(diào)整至20%，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為濃度調(diào)整至20%效果更佳，他們認(rèn)為20%的胎牛血清濃度既保證了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的彌散梯度，又提高了培養(yǎng)液的滲透壓，且有利于減輕器官腫脹。另外，Gawri等[33]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)保留軟骨終板的完整椎間盤整體器官很少出現(xiàn)腫脹，故而認(rèn)為保留軟骨終板對(duì)預(yù)防離體椎間盤腫脹是行之有效的方法。因而，本研究所使用的培養(yǎng)液將胎牛血清濃度提高至20%，并采用包含有軟骨終板的整體椎間盤器官進(jìn)行培養(yǎng)。

3.5 器官模型的評(píng)估指標(biāo)

HE染色法被廣泛用于科研，它可以顯示椎間盤各層組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)，被認(rèn)為是研究椎間盤組織形態(tài) 學(xué)的 重要 技術(shù) 。Thompson 等[34]和 Sobajima 等[35]通過HE染色觀察到退變晚期的椎間盤組織發(fā)現(xiàn)纖維環(huán)的層狀結(jié)構(gòu)紊亂，髓核和纖維環(huán)界限不清，髓核由膠凍樣組織變成纖維軟骨組織，且體積變小，軟骨內(nèi)形 成骨贅，椎間盤出現(xiàn)裂隙 。故而可以認(rèn)為 IDD 的組織形態(tài)學(xué)標(biāo)志是軟骨終板鈣化，纖維環(huán)破裂，軟骨下骨贅形成等。本研究亦將HE染色法作為器官模型組織形態(tài)學(xué)改變的觀察方法。本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)至第7 d，兩組均未出現(xiàn)組織形態(tài)學(xué)改變；培養(yǎng)至第 14 d，兩組均出現(xiàn)退變改變。

NBT染色劑可以著色于活細(xì)胞的線粒體，且NBT染色可直接加入培養(yǎng)液內(nèi)與活細(xì)胞結(jié)合而反映細(xì)胞的存活狀態(tài)；DAPI染色劑能穿過包括活細(xì)胞和死亡細(xì)胞的所有細(xì)胞的細(xì)胞膜與DNA 雙螺旋結(jié)合。Lim等[36]選用 NBT 和 DAPI復(fù)染細(xì)胞，只被 DAPI單染的細(xì)胞視為死亡細(xì)胞，而被復(fù)染的細(xì)胞視為活細(xì)胞，通過計(jì)算兩者比例以觀察細(xì)胞的存活率。徐宏光等[37]在前期培養(yǎng)大鼠椎間盤體外器官模型研究中亦應(yīng)用此法計(jì)算椎間盤軟骨細(xì)胞的成活率。本研究應(yīng)用NBT染色法和DAPI復(fù)染法對(duì)器官模型進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組培養(yǎng)第 14 d 與 0 d 比較，培養(yǎng)第 7 d 加力組與對(duì)照組比較，培養(yǎng)第 14 d 加力組與對(duì)照組比較，細(xì)胞成活率均有不同程度下降。

椎間盤的功能與其基質(zhì)的變化密切相關(guān)，但對(duì)椎間盤基質(zhì)的研究也是當(dāng)今的難點(diǎn)所在。器官培養(yǎng)保留了基質(zhì)內(nèi)部、細(xì)胞間以及細(xì)胞與基質(zhì)間結(jié)構(gòu)的完整性，且是椎間盤細(xì)胞生存和代謝的原始環(huán)境，利用此模型對(duì) IDD 進(jìn)行研究具有很大優(yōu)勢(shì)[17]。目前較普遍應(yīng)用于各種基質(zhì)成分檢測(cè)的是 Realtime RT-PCR檢 測(cè) 和 Western-blotting 檢測(cè)，但各報(bào)道的 檢 測(cè)結(jié)果不完全相同。徐宏光等[38]應(yīng)用此法研究發(fā)現(xiàn)頸椎病組原代終板軟骨細(xì)胞AGN及COLⅡ的表達(dá)均低于未發(fā)生退變組。Risbud 等[30]運(yùn)用此法對(duì)培養(yǎng) 1 周的Wistar大鼠椎間盤 器 官 AGN、COLⅡ等基質(zhì) 成 分進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)均有下調(diào)，但1周后下調(diào)趨勢(shì)停止，其表達(dá)基本保持穩(wěn)定。Gantenbein 等[28]運(yùn)用此法對(duì)培養(yǎng)的羊椎間盤整體器官基質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)，AGN、COLⅡ表達(dá)均下調(diào)。本研究運(yùn)用此法對(duì)兩組器官模型在培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)上AGN、COLⅡ表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，顯示對(duì)照組第 7 d 的 AGN、COLⅡ表達(dá)未出現(xiàn)明顯下調(diào)，而第 14 d 的表達(dá)明顯下調(diào)。加力組第 7 d及第 14 d 的 AGN、COLⅡ表達(dá)均出現(xiàn)明顯下調(diào)。

3.6 壓力刺激對(duì)IDD 的影響

Horner和 Urban[27]研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤可因異常載荷作用而導(dǎo)致細(xì)胞死亡及基質(zhì)代謝紊亂，從而加速IDD的進(jìn)程。作用于椎間盤的異常載荷有很多種，如牽張力、剪切力和壓力等[37]，F(xiàn)reement[39]研究發(fā)現(xiàn)，壓力可致椎間盤細(xì)胞能量代謝障礙、細(xì)胞增值緩慢、細(xì)胞老化、基質(zhì)合成明顯減少以及大量炎性因子分泌等。這些因素均直接誘發(fā)椎間盤細(xì)胞的生物學(xué)行為改變，故而認(rèn)為壓力是導(dǎo)致IDD的重要誘因。目前，壓 力刺激引起 IDD 的具體機(jī)制尚不明確。Nie 等[40]認(rèn)為可能是壓力刺激致 AGN和COLⅡ的合成以及TGF-β1的分泌受到抑制，加上炎癥因子的過度表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，誘發(fā)椎間盤細(xì)胞老化及凋亡；Cassinelli等[41]認(rèn)為，異常壓力刺激使水分從椎間盤組織內(nèi)部溢出，基質(zhì)環(huán)境受到破壞，椎間盤細(xì)胞的存活率明顯下降，并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。本研究針對(duì)器官模型施加預(yù)先設(shè)定的一定值及周期的CMP載荷，于培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)觀察加力組器官模型組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞成活率及AGN、COLⅡ表達(dá)變化，以評(píng)價(jià)CMP載荷對(duì)IDD的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)加力組器官模型的組織形態(tài)學(xué)發(fā)生退變，細(xì)胞成活率下降，AGN、COLⅡ的mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)，且加力組器官模型隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)退變加重。再次表明異常壓力刺激是導(dǎo)致的重要因素。

綜上所述，本研究成功建立了短周期的兔椎間盤體外器官模型，所培養(yǎng)的器官模型在1周時(shí)間內(nèi)在大體組織形態(tài)學(xué)，細(xì)胞成活率及基質(zhì)結(jié)構(gòu)等方面與正常椎間盤保持相似，并在此模型基礎(chǔ)上闡明CMP載荷可直接導(dǎo)致椎間盤出現(xiàn)退變樣改變，為IDD的研究提供了一個(gè)相對(duì)理想的模型基礎(chǔ)，也為在此基礎(chǔ)上進(jìn)行力學(xué)相關(guān)性IDD的研究提供一種新的思路。

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In vitro organ culture of rabbit degenerative intervertebral disc under cyclic mechanic pressure and its significance*

XU Hongguang1**,ZHANG Pingzhi1,SONG Junxing1,HU Bin1,ZHAO Quanlai1,LV Kun2,ZHONG Min2,ZHANG Mengying2,SUO Qifeng2
(1.Department of Orthopedics;2.Department of CentralLab,Yijishan Hospital,WannanMedicalCollege,Wuhu 241001,Anhui,China)

Organ culture;Cyclic mechanic pressure;Intervertebral disc degeneration

國(guó)家自然科學(xué)基金（30973025）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81272048）；安徽省自然科學(xué)基金（1308085MH152）

**通信作者：徐宏光，E-mail:xuhg@medmail.com.cn