原料乳細(xì)菌總數(shù)快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展

孟憲梅，楊志國，孫肖明

（1.吉林工商學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062；2.糧油食品深加工吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130062；3.吉林市太太食品有限責(zé)任公司，吉林吉林132011）

原料乳細(xì)菌總數(shù)快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展

孟憲梅1，2，楊志國3，孫肖明1，2

（1.吉林工商學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062；2.糧油食品深加工吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130062；3.吉林市太太食品有限責(zé)任公司，吉林吉林132011）

概述了原料乳細(xì)菌總數(shù)快速檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀及最新研究進(jìn)展，對(duì)電導(dǎo)微生物技術(shù)、PCR技術(shù)、ATP生物發(fā)光技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、直接表面熒光過濾技術(shù)、酶聯(lián)免疫法、生物傳感器法、智能化圖像識(shí)別技術(shù)進(jìn)行了歸納，并對(duì)國內(nèi)的研究方向進(jìn)行了展望。

原料乳；細(xì)菌；快速檢測(cè)

原料乳營養(yǎng)豐富，是細(xì)菌良好的培養(yǎng)基，在擠乳、收集、貯藏、運(yùn)輸?shù)倪^程中極易污染細(xì)菌。目前我國乳品企業(yè)應(yīng)用的細(xì)菌檢測(cè)方法，主要有培養(yǎng)法和染色法兩種，雖然具體操作程序有所不同，但是都存在著耗時(shí)、費(fèi)力、操作繁瑣等不足，影響著企業(yè)對(duì)原料乳品質(zhì)的正確判別和生產(chǎn)。因此準(zhǔn)確、快速、容易操作的細(xì)菌快速檢測(cè)方法正在成為乳品企業(yè)關(guān)注的重點(diǎn)，直接決定著企業(yè)產(chǎn)品品質(zhì)與綜合競(jìng)爭(zhēng)力的提升。本文綜述了目前世界乳品領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用較為成熟的檢測(cè)方法，并對(duì)各種方法進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)也對(duì)正在進(jìn)行研究的最新檢測(cè)手段進(jìn)行介紹。

1 電導(dǎo)微生物技術(shù)

該技術(shù)的工作原理是基于微生物生長(zhǎng)導(dǎo)致樣品電導(dǎo)率的變化，其方便之處在于，只要樣品本身是液態(tài)就可以直接注入培養(yǎng)瓶中不需要經(jīng)過稀釋。微生物在培養(yǎng)過程中，使得液態(tài)樣品中的糖類發(fā)酵成乙酸、乳酸等，蛋白質(zhì)變成氨基酸，由不導(dǎo)電的大分子變成導(dǎo)電小分子，從而改變培養(yǎng)瓶中液體的電導(dǎo)率。電導(dǎo)率從基線到明顯增加的點(diǎn)，稱為檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)短與液態(tài)培養(yǎng)物中微生物總數(shù)多少關(guān)系密切，數(shù)量越多，檢測(cè)時(shí)間越短，數(shù)量越少，檢測(cè)時(shí)間就越長(zhǎng)[1]。劉玲君等[2]應(yīng)用英國的MALTHUS微生物快速分析儀，電熱恒溫培養(yǎng)箱等對(duì)100個(gè)污染度梯度不同的原料乳樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用平皿計(jì)數(shù)法進(jìn)行對(duì)照。結(jié)果表明方法可行，且具有測(cè)定結(jié)果更快捷、省力。由于資料收集自動(dòng)進(jìn)行，測(cè)試可以不間斷，使原料奶得以更及時(shí)、更快的監(jiān)測(cè)，具有傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法測(cè)試所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)。但是當(dāng)檢測(cè)樣品中含菌量少的樣品時(shí)需要時(shí)間長(zhǎng)（16 h～20 h），并且設(shè)備昂貴，難以普及是該種技術(shù)方法目前存在的缺點(diǎn)。

2 PCR技術(shù)

2.1 熒光定量PCR技術(shù)

熒光定量PCR技術(shù)是一種目前國內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛的定量PCR技術(shù)，是通過始點(diǎn)定量和熒光檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)累積熒光強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)的，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、線性關(guān)系好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[4]。楊君[5]等采用收集離心后的細(xì)菌沉淀加入裂解液，煮沸裂解后獲取細(xì)菌DNA，然后應(yīng)用熒光定量PCR法擴(kuò)增檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)，全程耗時(shí)僅1 h～2 h，與該試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比的包括傳統(tǒng)的國標(biāo)平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法和3M培養(yǎng)法，結(jié)果顯示，通過熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)操作方便、靈敏、檢出限低，雖然該方法與國標(biāo)培養(yǎng)定量法所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)存在差異，但是都在可接受的實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)，可應(yīng)用在原料乳細(xì)菌總數(shù)的快速檢測(cè)中。

2.2 多重PCR技術(shù)

多重PCR是指在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物，然后針對(duì)多個(gè)DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的PCR技術(shù)[6]。在污染食品的致病菌中常見的有沙門氏菌、單增李斯特菌、金葡菌等，主要通過食品、飲水感染人類，導(dǎo)致細(xì)菌性食物中毒。武衛(wèi)影等[7]應(yīng)用三重PCR技術(shù)將食品中常見的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌經(jīng)6 h～8 h內(nèi)快速檢出，為3種食源性致病菌檢測(cè)試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。BaiY（2013年）等[8]應(yīng)用氨基修飾硅殼磁性納米顆粒（ASMNPs）結(jié)合多重PCR（M-PCR）對(duì)人為污染腸炎沙門氏菌和李斯特的原料奶進(jìn)行檢驗(yàn)，其敏感程度已經(jīng)達(dá)到15CFU/mLand 25CFU/mL。

3 ATP生物發(fā)光技術(shù)

ATP存在于包括細(xì)菌在內(nèi)的一切活體細(xì)胞組織中，當(dāng)熒光酶系統(tǒng)和ATP接觸時(shí)就會(huì)發(fā)光，且光的強(qiáng)度與細(xì)菌的ATP含量成正比，這為快速檢測(cè)樣品中是否存在細(xì)菌提供了非常有利的依據(jù)[9-10]。田麗萍[11]曾用ATP生物發(fā)光技術(shù)與丹麥福斯的FOSS細(xì)菌總數(shù)測(cè)測(cè)定儀進(jìn)行原料乳中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)比較，在25℃條件下，采用BLW 0401微量光度計(jì)，將細(xì)菌細(xì)胞通過裂解劑裂解從而釋放其中的ATP，并應(yīng)用熒光素酶進(jìn)行檢測(cè)，得到與細(xì)菌細(xì)胞數(shù)對(duì)應(yīng)的發(fā)光值。從試驗(yàn)結(jié)果可知，ATP生物發(fā)光技術(shù)與FOSS細(xì)菌總數(shù)測(cè)定儀在檢測(cè)原料乳細(xì)菌總數(shù)方面存在較高相關(guān)性（R2=0.905 3）。該技術(shù)能夠在2min～5min內(nèi)快速檢出原料乳中的細(xì)菌總數(shù)，且成本低廉，值得推廣。Sharpe等[12]也經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)，證明了ATP生物發(fā)光技術(shù)在快速檢測(cè)原料奶細(xì)菌總數(shù)方面確實(shí)可靠。李春艷[13]等將ATP生物發(fā)光法進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果是，乳中微生物總數(shù)與光值呈正的直線相關(guān)（r=0.948 5），相關(guān)程度為顯著相關(guān)（P＜0.001），線性回歸方程為：y=1.049 6x+2.4。同時(shí)與平皿培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果做比對(duì)，結(jié)果表明兩種方法顯著相關(guān)。

4 流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是一種對(duì)液流中排成單列的細(xì)胞或其它生物微粒（如微球，細(xì)菌，小型模式生物等）逐個(gè)進(jìn)行快速定量分析和分選的技術(shù)[14]。該技術(shù)無需對(duì)樣品進(jìn)行培養(yǎng)可直接檢測(cè)樣品中細(xì)菌的性質(zhì)和數(shù)量，同時(shí)具有高度敏感和應(yīng)用廣泛以及節(jié)省時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。主要原理是讓帶菌的樣品流經(jīng)流式細(xì)胞儀小孔，通過檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞與周圍介質(zhì)的電傳導(dǎo)率的差異；或選用激光為發(fā)光源將聚焦后的光束垂直照射到樣品流上，分析光的散射情況；或用熒光物質(zhì)標(biāo)記細(xì)胞，檢測(cè)熒光信號(hào)。光的散射代表著細(xì)胞體積的大小，熒光信號(hào)的強(qiáng)度則反映了所測(cè)細(xì)胞膜表面抗原的強(qiáng)度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度，由此來定性和定量地判別微生物[15]。該技術(shù)早在1997年由Zee H[16]曾經(jīng)在UHT的加工過程中有過應(yīng)用報(bào)道。Pettipher[17]等（2005年），使用FCM快速檢測(cè)牛奶中污的細(xì)菌數(shù)量，并取得了較為理想的實(shí)驗(yàn)效果。但缺點(diǎn)是設(shè)備昂貴?，F(xiàn)在應(yīng)用最多的是產(chǎn)品有丹麥福斯公司研制的FOSS細(xì)菌總數(shù)測(cè)測(cè)定儀（BactoScan FC）。

5 直接表面熒光過濾技術(shù)

直接表面熒光過濾技術(shù)（Direct Epifluorescent Filter Technique DEFT）是一種直接測(cè)定樣品中細(xì)菌總數(shù)的快速檢測(cè)法，可用于檢測(cè)樣品中活菌數(shù)量，由英國科學(xué)家Pettipher[18]設(shè)計(jì)開發(fā)，最初的目的是為了檢測(cè)牛奶樣品。其工作原理為吖啶橙染料以單體形式與雙股DNA結(jié)合，經(jīng)熒光顯微鏡觀察可見出綠色熒光；以多體形式與單股DNA結(jié)合，經(jīng)熒光顯微鏡觀察橙色或者橙黃色熒光，而單股DNA只存在于活細(xì)胞中，因此可通過光的顏色判定樣品是否存在活菌，并且通過表面熒光顯微鏡對(duì)具有熒光的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。試驗(yàn)證明[19]，該種方法測(cè)得樣品細(xì)菌總數(shù)與傳統(tǒng)的國標(biāo)平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果相符，相關(guān)系數(shù)為0.81～0.91。

DEFT計(jì)數(shù)能在24 h內(nèi)預(yù)測(cè)5℃和11℃下保存的巴氏殺菌乳的質(zhì)量是否一致每個(gè)樣品的檢測(cè)時(shí)間約25min費(fèi)用為1美元。缺點(diǎn)是由于熒光抗體能與食品中固有微生物發(fā)生非特異性反應(yīng)因此在使用DEFT技術(shù)時(shí)有可能獲得假陽性結(jié)果，熒光顯微鏡、圖象分析儀等設(shè)備昂貴。

6 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，ELISA）是將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，把受檢標(biāo)本測(cè)定其中的抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體與固相載體表面的抗體或抗原反應(yīng)，加入底物顯色后，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析[20]。鄢志剛等[21]用單抗直接ELISA、PCR法分別對(duì)海地區(qū)5個(gè)牛場(chǎng)原料奶，采146份樣品進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)，并用國標(biāo)方法進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示，直接ELISA法檢測(cè)15個(gè)陽性樣品，131個(gè)陰性；PCR法和國標(biāo)法檢測(cè)出的結(jié)果都是12個(gè)陽性。最終發(fā)現(xiàn)直接ELISA法的敏感性達(dá)100%，特異性很高，與國標(biāo)復(fù)合率超過90%。是對(duì)大量樣品進(jìn)行粗選較好的選擇。楊愛萍等[22]用單抗酶聯(lián)試劑盒與PCR法快速檢測(cè)沙門氏菌，結(jié)果也證實(shí)了ELISA法檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)，并且假陽性率一般在2.5~3之間，且可在短時(shí)間內(nèi)快速篩去大量陰性樣品。

7 生物傳感器法

生物傳感器是小型、便攜的分析裝置，它是將具有分子識(shí)別功能的生物識(shí)別元件和信號(hào)放大轉(zhuǎn)換元件緊密結(jié)合的分析裝置[23]。其工作原理是將待測(cè)物質(zhì)與某種生物活性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)所產(chǎn)生的信號(hào)，經(jīng)由換能器轉(zhuǎn)換成為電子信號(hào)，再將該信號(hào)經(jīng)放大器放大輸出，從而反應(yīng)出待測(cè)物質(zhì)的濃度信息[24]。盧智遠(yuǎn)等[25]應(yīng)用色素還原試驗(yàn)法的原理，利用自制的電化學(xué)生物傳感器，對(duì)細(xì)菌在氧化還原過程中生成的電子數(shù)進(jìn)行計(jì)測(cè)，最終測(cè)定乳制品中的細(xì)菌總數(shù)，該方法快速有效且能確定總量。但是由于生物本身具有不穩(wěn)定性，經(jīng)由傳感器放大后的可檢測(cè)信號(hào)波動(dòng)較大，所以在具體應(yīng)用中容易出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的偏差。

8 智能化圖像識(shí)別技術(shù)

該技術(shù)是完全本土化的，由中國農(nóng)業(yè)機(jī)械化科學(xué)研究院研發(fā)的一種快速原料奶細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)系統(tǒng)。目前該技術(shù)還沒有在國外應(yīng)用于乳業(yè)的資料，是一種新的嘗試。其過程為首先通過生物顯微鏡和數(shù)碼圖像裝置獲取原奶中細(xì)菌的數(shù)字化圖像，然后交由計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)，再由專門的智能圖像識(shí)別系統(tǒng)將圖像特征提取，與數(shù)據(jù)庫中原有的標(biāo)準(zhǔn)特征圖像進(jìn)行對(duì)比分析，最終檢測(cè)出細(xì)菌總數(shù)，也可進(jìn)一步判斷細(xì)菌的類別[26]。智能化圖像識(shí)別系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)是其檢測(cè)過程具有良好的直觀性，是真正的直接檢測(cè)。不過，在細(xì)菌顯微圖象的轉(zhuǎn)換和計(jì)算機(jī)識(shí)別與計(jì)數(shù)環(huán)節(jié)，還需要開發(fā)專門的智能軟件。將整個(gè)過程進(jìn)一步簡(jiǎn)化、易于操作，結(jié)果更加可靠。

9 結(jié)束語

原料乳細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)方法很多，包括傳統(tǒng)檢測(cè)方法和正在研究中的快速檢測(cè)方法，每種方法都存在著自身的優(yōu)缺點(diǎn)，人們?cè)诔錆M期待的同時(shí)，目前應(yīng)用較多的還是傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法。一種快速檢測(cè)方法是否可以廣泛推廣，應(yīng)該從一下幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)去判斷：人力，是指檢測(cè)是否可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，檢測(cè)設(shè)備操作是否繁瑣復(fù)雜；財(cái)力，是指檢測(cè)設(shè)備的資金投入與每次檢測(cè)所需費(fèi)用，是否能夠被乳品企業(yè)接受，成本核算是否合理；時(shí)間，是指每次檢測(cè)從樣品處理到分析結(jié)果最終確定消耗的時(shí)間，是否能夠達(dá)到在線檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；可靠程度，是指最終結(jié)果的準(zhǔn)確度是否符合該樣品相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)要求。從目前發(fā)表的各種研究報(bào)告可以發(fā)現(xiàn)，世界發(fā)達(dá)國家從20世紀(jì)60-70年代就已經(jīng)在實(shí)際生產(chǎn)中開始應(yīng)用快速檢測(cè)技術(shù)，而我國由于乳用動(dòng)物的養(yǎng)殖比較滯后，除了沿用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)，多數(shù)企業(yè)還是依靠從國外進(jìn)口設(shè)備和儀器來實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。因此加快快速檢測(cè)的研究步伐，達(dá)到世界先進(jìn)水平是當(dāng)下國內(nèi)科研工作者的當(dāng)務(wù)之急。

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Research Progress on Rapid Detection of Total Quantity of Bacteria in Raw M ilk

MENGXian-mei1，2，YANG Zhi-guo3，SUNXiao-ming1，2

（1.Jilin Business and Technology College，changchun 130062，Jilin，China；2.Key Laboratory of Grain and Oil Processiong of Jinlin Province，changchun 130062，Jilin，China；3.Mrs Food limited liability company of Jilin City，Jilin 132011，Jilin，China）

The current research status and the latest research progress on rapid detection of total quantity of bacteria in Raw Milk were reviewed.The methods of rapid detection for total quantity of bacteria included conductancemicrobiology technique，PCR，ATP bioluminescence technique，flow cytometry，directepifluorescent fiIter technique，enzyme-linked immunosorbentassay、biosensormethod，intelligentimage recognition technique．Finally，thedomestic developmentdirectionofcorrelated researchworkwasalsoprospected.

rawmilk；bacteria；rapid detection

蔣偉.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定漢灘病毒滴度方法的建立[D].第四軍醫(yī)大學(xué),2011.

10.7666/d.d220428

2014-06-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.038

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（201205054）；糧油食品深加工吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放資金項(xiàng)目（2014001）

孟憲梅（1964—），女（漢），教授，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向：食品安全及食品生物技術(shù)。